昼夜节律与衰老的研究

何本进　梁庆华　胡才友　孙　亮　朱小泉　原惠萍　杨　帆　李星慧

秦娇琴1,2　贾春媛2　韩　晶2　杜建财2　张翻弟2　杨　泽2

国家科技部十二五支撑计划(2012BAI10B01)； 北京市科技新星计划(Z121107002512058)

昼夜节律与衰老的研究

何本进1,2梁庆华1※胡才友1※孙亮2朱小泉2原惠萍2杨帆2李星慧2

秦娇琴1,2贾春媛2韩晶2杜建财2张翻弟2杨泽2

国家科技部十二五支撑计划(2012BAI10B01)； 北京市科技新星计划(Z121107002512058)

【摘要】多数生物是以24小时或近似24小时为周期而显示出明显的昼夜节律。昼夜节律控制着觉醒与睡眠的更替，即使在全天照明或黑暗的环境条件下也照常运行。尽管在无光照条件下，昼夜节律也能自由运行，但光照对于该节律的设置调整则具有重要作用。通过温度改变、人工光照或人工黑暗条件，监测生物的生理、生化等活动是否会随昼夜节律的改变而发生变化。本文主要就纤细裸藻在温度或光照等条件的改变下，其细胞分裂周期、酶活性、芳香族氨基酸代谢等生理生化活性变化进行了综述。

【关键词】纤细裸藻昼夜节律细胞分裂周期昼夜振荡器

纤细裸藻Z的生理组织已被广泛研究超过了40年[1～5]。这种裸藻能够在各种合成的培养基中生长，或者在CO2，VitB1和VitB12存在时进行光合自养，或者在光或暗条件下，碳源从乙酸乙酯和乙醇到乳酸、乙酸、谷氨酸和苹果酸，在pH有很大范围变动时进行有机自养。这种生长方式的功能多样化，与细胞分裂结合，通过24小时的光照日程表和温度循环[6～8]，很容易地被同步化，使裸藻作为生理生化研究成为一种重要的试验性生物。

如表1所示，已经报道过许多持续的昼夜节律。这些研究得助于以下事实：数天或者数周后裸藻在细胞浓度上很少甚至不发生任何变化，仍维持“静止”的生长相(超昼夜的生长模式)。从细胞分裂周期推动力分离时，昼夜节律可以被监测到。实际上许多光合作用突变体(甚至使缺乏叶绿体基因组的株系完全褪色)已经被分离，但仍然有效地显示出光的昼夜节律，作为一种生长能源和潜在时钟的时间提示，已经消除应用在光跨度和信号上的问题。

因此裸藻的系统为暂时变异提供了一个极好的例子：不同的行为、生理生化活动沿着24小时轴线被划分,为环境适应和功能整合及时提供标尺[2，3]。 峰值图(图1)很好地解释了这种昼夜时间结构，提供了一个便捷的方法去说明节律的关系(通过余弦法或其他方法分析)：昼夜(LD)循环同步化(或其他“定时者”)、生物的周期转换或自由运行条件[3]。

1.昼夜节律株系入选种类的调查

下面，我们较详细调查了表1编号的昼夜节律，其中主要综述已经报道过，调查这些领域更多的新进展。

表1　纤细裸藻的昼夜节律时间结构

续表1

(摘自：Edmunds Jr LN, Halberg F.In: Kaiser HE, ed.Neoplasms—Comparative Pathology of Growth in Animals, Plants and Man.Baltimore, Md: Williams & Wilkins; 1981:105-134.? 1981 The Williams & Wilkins Co.)

比较纤细裸藻细胞分裂周期中昼夜节律的世代时间(g)与自由运行周期(τ)之间的温度效应。(A)温度对两种维持在3小时光照：3小时黑暗(7,500勒克斯)的不同株系(Z为野生型；ZR为DCMU抵抗型)中平均世代时间(g)的影响。在指数生长期，光强度没有成为限制(通常在10,000到60,000 cell/ml之间)，在每一个温度得到的生长曲线，通过线性回归(最小二乘法)获得斜率，符合用直线法。(B)在3小时光照：3小时黑暗中培养的Z和ZR株系，细胞分裂的自由运行昼夜节律τ的温度补偿。细胞分裂(r)连续发生时周期会被检测，直到生长稳定期到达(通常细胞浓度约为100,000cells/ml)。在较低温度下，ZR株系里这个周期有一些延长。尽管Z株系可以在温度少于22℃(ZR为18℃) 时获得生长，但节律性却消失了。误差线条表示±1SD。(摘自Anderson RW, Laval-Martin DL, Edmunds Jr LN.Exp Cell Res 1985; 157:144-158.ⓒ Academic Press.)图2　不同恒温效应的研究

2.温度补偿

一个显著的昼夜节律特性就是它们的周期，而不是振幅，仅轻微受超生理范围的环境稳态温度影响。这只是预期一种功能生物钟去测量太阳日。相反，细胞分裂周期的持续时间是高度依赖于温度，对于裸藻更是这样[8]。 (图2A)一项不同恒温效应的研究，范围16～32℃，野生型Z(与DCMU-抗ZR线一样)的世代时间(g)，在3小时光照：3小时黑暗中通过光合自养分批培养，可以明确地说明这一依赖关系。

在不同的稳态温度， 3小时光照：3小时黑暗里，维持裸藻Z和ZR株系中自由运行周期温度补偿的一个较广泛的对比研究，在前者中发现温度系数Q10为1.05 (图2B)，表明它实际上不受温度超过10℃(22～32℃)范围变化的影响。昼夜时钟也不是在ZR中得到补偿，其中超过18～28℃温度的范围会观察到Q10的平均值为1.23。然而，与典型的生化反应速率和其他生物过程(譬如膜运输)相比， ZR的昼夜振荡器仅适当地受到温度的影响。最后发现Z(ZR为18℃)临界的允许温度为22℃：尽管在较低温度能发生缓慢的指数生长，但同步性却没有见到。

3.光捕获蛋白的昼夜节律合成

在连续光照生长的纤细裸藻细胞，通过在体内用[S]甲硫氨酸标记蛋白，Künne 和de Groot证实更早的观察值 ——总蛋白质合成是有昼夜节律的，甚至这个τ仅受温度轻微影响。三种蛋白(由SDS-PAGE分离)分子质量分别为17 kD,24 kD和60 kD， 发现其有节律地合成(τ ～26 h)。这个60 kD 的蛋白大概在昼夜时间(CT)11处有一个最大合成速率，而另外两个更小蛋白约在人工的中午(CT05-08)显示有峰值(图3)。当最大值和最小值相比较，合成速率振荡超过20倍。超过16～27℃的温度范围, τ只有3～5小时的不同，反映出相当好的自由运行周期的温度补偿。两个较小多肽的合成被放线菌酮抑制，而不被氯霉素抑制，意味着合成发生在80S核糖体。合成和加工后，尽管会在黑暗中慢慢降解，但它们在连续光照时可以相当稳定，约为120小时。

纤细裸藻光捕获蛋白合成的昼夜节律在12小时光照：12小时黑暗中培养，在连续光照中解除。在17 kD 、24 kD和60 kD蛋白的合成比率中，振荡器可被光密度痕迹计算，这些痕迹通过细胞用[S]甲硫氨酸标记和SDS-PAGE法 分离，扫描可沉淀蛋白分数的荧光显影图获得 。相对合成是通过标记蛋白的相关峰值区域与它们相对应的凝胶泳道的总积分来定量计算的 。17 kD 和24 kD蛋白稍后被鉴定为光捕获叶绿素蛋白(LHCPs )家族。(摘自 Künne A, Pistorius E, de Groot E.Eur J Cell Biol，1997，73:175-181.ⓒ Urban & Fischer Verlag.)图3　光捕获蛋白的昼夜节律合成

随后，两个较小蛋白质被鉴定为光捕获叶绿素蛋白质(LHCPs)家族，Ⅰ类(17kD) 和Ⅱ类(24kD)，由抗LHCP Ⅱ血清检测，二维PAGE分离的蛋白质N-末端序列。尽管LHCPs的总量几乎在12小时光照:12小时黑暗中保持恒定，但与光照相位最大的合成量相比，新合成17kD和24kD蛋白质的量约改变20倍。相比之下，其特异的mRNAs只是轻微不同，有研究(应用转录抑制剂证实)发现：与大多数高等动物对比，LHCP合成的昼夜控制发生在翻译水平上。LHCPs合成的节律性完全可能在裸藻光合作用的昼夜节律控制中起到重要作用(见表1)。

4.酶活性的昼夜节律

裸藻中一些酶的活性已显示经历昼夜节律的变化，更多最新的典型实例见表1。

5.芳香族氨基酸代谢

纤细裸藻Z有两个重要的芳香族氨基酸代谢酶——色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)和酪氨酸氨基转移酶(TAT)表现出不同的节律模式。这两种酶由共同的调节机制相互关联，尤其是对于氨基酸向糖异生的控制。而TDO在连续光照里表现出显著的昼夜节律(峰值活动在CT18)，TAT以一个次昼夜的周期振荡(τ = 4.26小时)。甚至在12小时光照：12小时黑暗里,TAT表现出一个次昼夜的时间(～4.63小时)。因此，从动力学的角度看，这两种酶是可以分离的。在相同条件下，其他变量比如趋光性，细胞形状和总蛋白质合成也在昼夜节律的控制下(见表1)。

6.NAD激酶、NADP磷酸酶和线粒体钙循环

上图：在纤细裸藻缓慢分开自养的细胞，体内NAD+和总NADP(H)的含量的昼夜变动，仍维持在3小时光照：3小时黑暗。在不同的昼夜时间抽取两个不同相位的，自由运行的细胞样本，应用酶法(每个时间点2～5次测定)，分光光度计法测量NAD+的含量。曲线连接在CT()获得的所有数据点的平均值。总NADP(H)同以上操作(o 和·)。下图：典型生长曲线对于两者之一分析细胞非常相像。(在对数标尺上)划分细胞浓度作为CT ()的功能。很小的因子增加(ss=1.14)表明在周期里，只有自由运行群体的14%被分开 ，而在分裂间期，体内NAD+增加的数量达70%。(摘自： Goto K, Laval-Martin D, Edmunds Jr LN.Science，1985，228:1284-1288.ⓒ American Association for the Advancement of Science.)图4　NAD+和总NADP含量的昼夜变动

什么是调节这些酶的元素?因为在许多植物中Ca2+-钙调蛋白激活NAD+激酶，包括绿藻、海胆，因为NAD+激酶和NADP+磷酸酶的活性似乎由浮萍属体内复合物水平中的节律产生，它也将可能是绿藻时钟元素的候选。或者用2小时到3小时氯四环霉素脉冲，可透过膜的Ca2+螯合剂直接引起Ca2+的短暂减少，或者通过W7和氯丙嗪——两个钙调蛋白抑制剂的相似短脉冲来暂时抑制Ca2+-钙调蛋白，试图干扰时钟。 所有这三种药都相位漂移分裂节律。它们的相位反应曲线暗示，胞浆Ca2+和钙调蛋白组成时钟的齿轮。如果是这样，裸藻中将会有另外一个齿轮直接调节Ca2+的水平。许多非昼夜系统的主要调节位点为原生质膜、内质网和线粒体。为了检测可能性，线粒体的Ca2+运输系统也许是一个时钟齿轮，用氮气、二硝基苯酚，或者乙酸钠，细胞会振荡(2～3小时)，所有这些都影响电子转移，ATP水解和线粒体的Ca2+外流。每一种试剂都相位漂移分裂节律。

基于这些发现，Goto 等拟建一个模型，其中NAD+、线粒体的Ca2+-运输系统、Ca2+、钙调蛋白、NAD+激酶和NADP+磷酸酶将代表全部的时钟元素，可能组成一个自激的，昼夜振荡环——不是这个“时钟”而最可能是一个“时钟商店”的振荡器。这个拟建的反馈回路能自动振荡，因为这个“交互耦合” 总是起相反的信号。这两种酶的节律性活动会因为Ca2+-钙调蛋白复合物，其中一个效应器在胞质浓度的昼夜变化，反相振荡180°，从而激活NAD激酶，但抑制 NADP磷酸酶。

随后体内研究在连续黑暗里，裸藻ZC突变株的两种同步分裂和自由运行分裂细胞的可溶的膜结合部分，在NAD激酶和NADP磷酸酶的活动中检测到昼夜节律变化。在分裂细胞(峰值在CT00 和 CT12)发现总NADP磷酸酶活性中双峰的昼夜节律。当细胞已经停止分裂，在CT00-03处可观察到峰值的消失，有一种结果提示，这可能受细胞分裂周期所调节。NAD激酶活性，在分裂细胞中显示单峰的昼夜节律(峰值在CT12)，在细胞已经进入静止的生长相后，其继续保持相同的相位。在不同的昼夜节律，Km及饱和的条件下，测量由酶催化的反应相对速度，并计算它们的比率。由NADP磷酸酶获得的值显示节律性的复模式，而由NAD激酶获得的值显示，在酶活性中，昼夜变动与节律非常相关。两个分裂及不分裂的细胞在CT00-04显示曲线的波谷；分别从一个分裂或静止的细胞中取样，细胞在CT18-20或CT08-14显示峰值。这样的变化表明酶动力学性质的改变，其反映的是亲和力的修饰或者因为效应器(如Ca2+-钙调蛋白)或者因为NAD+的底物。原因可能是：①在不同的昼夜时间中，不同同工酶的表达；②酶的不同翻译后修饰；③昼夜方式中效应器浓度的不同。

7.腺苷酸环化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)、环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)

在(12小时光照：12小时黑暗)产生或者(1/2小时光照：1/2小时黑暗)自由运行环境下，分裂和不分裂光合自养的纤细裸藻野生型Z细胞里，发现总cAMP含量有双峰的昼夜节律(峰值在CT09-14, CT19-22)。这些发现证实，cAMP含量的双峰节律受周期振荡器(CO)调节，而不是依赖细胞分裂周期(CDC)。

同样地，在cAMP的水平上，无叶绿素的ZC突变株的细胞也展现出双峰的昼夜节律变化(图5)。cAMP 水平的最大值出现在光周期的起始(CT00-02, 细胞处在G1期)和黑暗的开始(CT12-14, 对应于 M期的起始)。这些变化好像是独立的细胞分裂周期，因为当细胞已到静止期，它们仍持续(图5B,C)，然而较多新近结果指出，在后期静止条件下的细胞群体，cAMP 水平的振幅也许变得减弱。通过光信号，由细胞节律的相位重置优先得到——在某种程度上，通过相位反应曲线(PRC)预测，cAMP浓度里的这些振荡通过光信号能被相位漂移。

在同时分裂和不分裂无叶绿素的纤细裸藻ZC突变株(Z株)细胞，自由运行cAMP水平的振幅在16.5℃，添加有乙醇(0.1%, v/v) 的矿质细胞基上生长。(A)在细胞里体现出有节律的细胞分裂，cAMP水平的昼夜变化，通过12小时光照：12小时黑暗循环向24小时周期改变。(B)细胞停止分裂后cAMP水平的双峰24小时振荡的持续性。(C)刚进入静止生长期和在DD (τ=27小时)显示自由运行分裂节律的细胞cAMP水平的变化。为了试验A和B，从两种细胞中通过异相昼夜循环改变，超过一个12小时时间间隔，每2小时准备细胞抽提物，这样扫描整个昼夜周期。双绘制(开符号)结果作为昼夜时间(CT)功能。在试验C中，超过一个34小时时间间隔，每2小时准备细胞提取物。为了使曲线A和B容易对比，结果规范到一个24小时周期。(摘自Carré I, Laval-Martin DL, Edmunds Jr LN.J Cell Sci, 1989, 94:267-272.ⓒ1993 The Company of Biologists, Ltd.)图5　Z株细胞cAMP水平的昼夜变化

cAMP代谢路径的关键因素是负责生成和降解的两个酶，也就是腺苷酸环化酶(AC)和磷酸二酯酶(PDE)。在12小时光照:12小时黑暗里，发现这些酶在两种分裂和不分裂的裸藻ZC突变株细胞里的活性，经历双峰的昼夜节律变化，尽管较新的结果提示，节律的振幅在稍后静止期群体里是衰减的。AC的最大活性出现在光照间隔(CT02)开始后的2小时和黑暗(CT12-14)的起始；这些时间相当于峰值期的外形，作为cAMP 含量节律的变化，之前已有报道过(图5)。PDE的活性也显示每日振荡，但有一个反相模式。在连续黑暗中，AC和PDE两者的活性节律持续(图6)。

在连续黑暗中维持的裸藻ZC突变株的静止细胞，超过一个40小时时间间隔，检测AC活性(A)和PDE活性(B)中自由运行的昼夜节律。在这些细胞已停止分裂前，被12小时光照:12小时黑暗同步化的细胞，不久就被转移到了DD；因为在CT12，最后分裂爆发的开始被当作相位基准点。阴影线条：人工黑夜。自由运行周期已经被规范为24小时。(摘自Tong J, Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci 1993; 100:365-369.ⓒ1991 The Company of Biologists, Ltd.)图6　Z株细胞AC和PDE自由运行的昼夜节律

毛喉素可大大激活AC的活性，高度特异的AC催化剂能直接充分刺激AC的活性，但与G蛋白无关。贯穿一天24小时，毛喉素对AC的刺激不能引起相同的效果，但可随着昼夜时间(CT)而变化。通过体内毛喉素脉冲，AC增强的程度似乎相反地依赖于AC的基础水平。因为在不同的CTs，毛喉素似乎能刺激AC活性到相同最大值而不论其初始基础水平，所以我们推断，酶的振荡活性来源于调节细胞效应器，起源于昼夜振荡器而不是酶蛋白自身的量的变化。

PDE是信号系统的一种重要成分，因为它负责合成脉冲后对cAMP 的破坏，因此允许细胞从cAMP 诱导的难降解状态中恢复。我们发现，在 CT20时，向完整细胞中添加50 μM 的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，相当于在PDE活性中节律的峰值(见图6B)，抑制约51%PDE活性，而在CT12 (波谷期)，IBMX 只有轻微(8%)作用。在裸藻提取物中观察到的PDE中， IBMX的这些CT依赖性抑制作用可能是对数个PDE种类的合力，其相对含量也可能随CT变化。这些结果显示，在生成cAMP含量的昼夜振荡里，AC和PDE两者的节律都是关键要素。

cAMP和cGMP 是第二信使，作为生物调节系统中二元论的“阴阳”类型，可能扮演着对立面。为了确定cGMP在裸藻的AC-cAMP-PDE 系统的昼夜节律性的调控中是否起作用，在同步的细胞群中监测cAMP和cGMP 水平，测量体内AC和PDE 的活性在cGMP 类似物8-溴环鸟苷酸(8-Br-cGMP)和cGMP 抑制物LY 83583 (6-苯胺基醌-5,8-醌)上的效果。在12小时光照：12小时黑暗或连续黑暗，分裂和不分裂细胞中发现cGMP 含量的双峰、24小时节律。cGMP 节律的峰值和波谷出现超过cAMP2小时。不同昼夜时间8-溴环鸟苷酸的添加，会提高体内cAMP水平2～8倍，而LY 83583减弱cAMP节律的振幅以致消失。AC和PDE活性的8-溴环鸟苷酸效应是依赖CT的，与cAMP 含量的变化一致。这些发现提示，cGMP可充当上游的效应器，通过AC-cAMP-PDE系统的调节来调整cAMP振幅。

8.环腺苷酸(cAMP)水平的昼夜节律性

我们已经讨论了cAMP水平的细胞分裂周期独立性、双峰昼夜节律 ，野生型裸藻和无叶绿素的ZC突变株(图5)，显示细胞分裂的自由运行昼夜节律。最大的cAMP 水平出现在光周期(细胞在G1期时CT00-02)的开始和黑夜(CT12-14,相当于M期的开始)的起始。最近已经报道过在烟草BY-2的同步悬浮细胞中，与细胞周期进程紧紧连接的cAMP波动。在G1期与 S期之间可以观察到 cAMP的峰值。消炎痛的应用，在动物细胞中抑制AC的药物，S期早期就导致S期cAMP峰值减低和在G2/M边界，通过阻塞细胞来抑制有丝分裂节律。

这些共同的结果提示，cAMP水平被内源性的时钟控制，调节细胞分裂周期和周期性的双峰的cAMP信号(由昼夜振荡器开始或连同它)，可能参与细胞分裂周期活动向昼夜周期特定相位安装闸门。

9.细胞分裂周期的昼夜节律控制模型

为了细胞分裂周期与昼夜振荡器的耦合，这些结果被纳入了模型(图7)。我们提议，在CT00-02时，cAMP激增会延迟DNA合成，在G2期在限制点保存细胞，在人工白天阻止细胞分裂。cAMP水平减低后，细胞从阻塞中释放，Grieco 等已经显示这与MPF的酪氨酸-去磷酸化-诱导激活密切相关，G2/M转变，或有丝分裂本身，在CT12-14时，由第二个cAMP峰值加速，结果有丝分裂被定相到人工黑夜。通过cPKA激活，人工夜晚中cPKB激活的有丝分裂刺激，引导人工白天中细胞分裂周期进程的cAMP的延迟效应。这些激酶中任何一个激活都会引起一组不同的目标的磷酸化作用和干扰不同细胞周期控制的通路。在细胞分裂周期的不同阶段可表达cPKA 和cPKB。作为一种选择，这些酶的水平可显示昼夜节律变化，人工白天时表达cPKA 和人工黑夜时表达cPKB。另一个可能性是，它们下游目标振荡中的一个水平，结果仅cPKA的激活在人工白天的细胞分裂周期进程中有效应， cPKB的激活在人工黑夜的细胞分裂周期进程中有效应。

在CT00-02时，cAMP激增延迟DNA合成(可能在G2期在限制点保存细胞) 在人工白天阻止细胞分裂。 cAMP水平减低后，细胞从阻塞中释放, 有丝分裂本身在CT12-14时，由第二个cAMP峰值加速，结果有丝分裂被定相到人工黑夜。通过两个cAMP依赖性激酶(cPKA, cPKB) 的活动来解释细胞周期进程中cAMP的相反效应，其在细胞分裂周期(或在昼夜周期的不同相位)的不同阶段中表达以及其有不同目标的配置。(摘自： Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci 1993; 104:1163-1173.ⓒ 1993 The Company of Biologists, Ltd.)图7　细胞分裂周期的昼夜节律

10.与细胞周期蛋白振荡器连接

通过(或者连同)我们已经识别的AC-cAMP-PDE 系统和cAMP依赖性激酶(cPKA 与cPKB)，昼夜振荡器最终是如何把调节细胞分裂周期的MPF时钟耦合在一起？ 最近，利用单克隆抗人clb1抗体蛋白，我们已经做western blot细胞周期蛋白B分析(MPF调节亚基)，在CT00峰值与CT12波谷的昼夜周期和CDC里，从分裂的ZC细胞数量多样化中发现了蛋白提取物同系物的丰度。然而，在静止期细胞的不分裂相里，分裂细胞中细胞周期蛋白的这些昼夜节律波动就会停止。

在连续黑夜，从ZC突变株中分裂的和静止相细胞的蛋白提取物的初步western blot分析，证实p34cdc2同系物的存在，早期在其他藻类，野生型裸藻中报道过MPF的催化亚单位，提示贯穿细胞分裂周期，其丰度是不变的，当细胞停止分裂，减少到很低的水平。还有，周期依赖方式的出现可观察到单体电泳移动的相对位移：一条更缓慢的移动带消失在CT09，在CT18时又出现。迁移率这种变化归功于磷酸化与去磷酸化作用。很明显，甚至静止期细胞，cdc2的磷酸化节律以昼夜节律周期(τ=26小时)持续着。 我们通过利用土豆酸性磷酸酶完全去磷酸化cdc2，然后用无抗-磷酸酪氨酸免疫反应性的单条带去跑，定性这些变化。这些最初的发现表明，多肽的活性取决于翻译后的机制。

很多利用未经处理的提取物最新结果已经揭示了除了去磷酸化蛋白，两种cdc2的磷酸化形式。这种更缓慢移动(更多的磷酸化)的形式在人工白天中占优势，是通过抗磷酸酪氨酸认可的唯一形式。在人工黑夜，这种更快移动、较少磷酸化形式出现在更缓慢移动形式减少的伴随物中。事实上，这种更快移动的缺乏酪氨酸磷酸化的磷酸化形式可能是苏氨酸磷酸化，在其他物种是一样的。然而到人工黑夜结束时，这种形式才消失，而更缓慢移动形式的量，在这两种残留物中被磷酸化，人工黎明前会升高。我们得出结论，cdc2可逆的酪氨酸磷酸化是与昼夜振荡器耦合在一起的。

最后我们注意到，Bjarnason 和 coworkers[7]已经检测到了在人类口腔黏膜和皮肤以及与特定的细胞分裂周期阶段关联中时钟基因的昼夜节律表达。在一个用24小时时间间隔来做活组织检查中，测定hClock,hTim,hPer1,hCry1和hBmal1的相对RNA表达的含量，发现其符合在啮齿动物的SCN和周边组织中发现显示昼夜节律轮廓。hPer1,hCry1和hBmal1是有节律性的，在清晨、午后和夜里分别达到峰值，而hClock,hTim无节律性。在合并的口腔黏膜活检里，胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性(DNA合成的标记物)有昼夜节律改变，峰值在下午初期，符合S相位的定时。hPer1表达的主要峰值如同口腔黏膜G1期的峰值，在同一时间出现，暗示昼夜节律和哺乳动物之间的联系。类似地，伴着G1后期, G1/S期, G2期和M期各自出现的峰值，发现细胞分裂周期蛋白、p53、 细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1有节律地改变。同样地，在一项68个老鼠肝脏再生的细胞分裂周期关联基因的分析中，利用DNA微列阵和Northern blot技术，Matsuo等已经显示，昼夜节律时钟直接控制wee1的表达，反过来调节活化的细胞周期蛋白B1-Cdc2激酶的表达和调节有丝分裂细胞的进入。这些发现对于化疗和放疗时间的设置有重要的临床意义，如同一份新近的研究报告所述，在小鼠的生理休息时间定量给药，凋亡药物比如多西他赛显示最小毒性和最高抗肿瘤疗效，另一项发现提示昼夜节律时钟能调整细胞分裂周期和凋亡过程(举例说，凋亡BCL 2-关联X蛋白的表达)。

11.小结

从以上综述可以清楚地看到，裸藻系统已经给昼夜节律提供了极好的例子。除了20多年前主要综述里引用的大数量例子[2]，许多新的不同行为的实例，生理生化活动被一些试验室记录沿着24小时轴线划分。这些包括光捕获叶绿素蛋白的昼夜节律变化、NAD+激酶和NADP+磷酸酶及线粒体钙循环的影响，整个腺苷酸环化酶—cAMP—磷酸二酯酶通路(与细胞周期蛋白p34cdc2/CDC28通用的细胞分裂周期“引擎” 搭配)。裸藻无性别，故不适合诸如脉胞菌、果蝇和拟南芥这些模型系统所提供的遗传解剖。但是在营养模式中它有多功能的优势，便于培养以及同步化细胞分裂周期，因为叶绿体舱的分解和对各种生理生化现象的贡献而易获得突变株。这些考虑能够在已经报道的昼夜节律时钟试验研究中得到支持并能继续研究做下去。尽管如此，今后仍需解决的问题是：应构建和完善丰富的不同物种的昼夜节律调控模型，进一步揭示昼夜节律在哺乳动物乃至人类生理活动与生化代谢中的调控过程，最终为人类治疗疾病和延长寿命提供新的理论基础。

参考文献

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6Matsuo T, Yamaguchi S, Mitsui S.et al.Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo[J].Science，2003，302:255-259.

7Means JC, Venkatesan A, Gerdes B, et al.Drosophila spaghetti and doubletime link the circadian clock and light to caspases,apoptosis and tauopathy[J].PLoS Genet，2015，11(5):e1005171.

8Dashti HS, Follis JL, Smith CE, et al.Gene-Environment Interactions of Circadian-Related Genes for Cardiometabolic Traits[J].Diabetes Care，2015，38(8):1456-1466.

作者单位：1.广西壮族自治区江滨医院检验科5300212.北京医院北京老年医学研究所100730

基金项目：国家自然科学基金(81061120527，81370445，81472408, 81400790)；卫生部公益性研究基金(201302008)；

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2015.04.005

收稿日期：2015-6-27

The research of biont in Circadian rhythms and aging degenerative process(HEBenjin1,2,LIANGQinghua1,HUCaiyou1,SUNLiang2,ZHUXiaoquan2,YUANHuiping2,YANGFan2,LIXinghui2,QINJiaoqin1,2,JIAChunyuan2,HANJing2,DUJiancai2,ZHANGFandi2,YANGZe2.1.Departmentofclinicallaboratory,Jiangbinhospital,Nanning,Guangxi530021,China.2.InstituteofGeriatrics,MinistryofHealth,BeijingHospital,Beijing100730,China)*Correspondingauthor:LIANGqinghua,HUcaiyou.

【Abstract】Most organisms exhibit clear circadian rhythm based on 24h or approximately 24h cycle.Circadian rhythm controls the replacement of wakefulness and sleep,it also runs normally even in light or dark condition throughout the day.However,circadian rhythm is also free-running under the condition of no light,and the setting of illumination to the rhythm plays a key role.Whether the physiological and biological activities of monitoring the organisms will change,following the variation of the circadian rhythm by changes in temperature,subjective light or dark conditions.We review the variations of physiological and biological activities of cell division cycle, enzymatic activity and aromatic amino acid metabolism in Euglena gracilis Klebs under the change of temperature or illumination condition.

【Key words】Euglena gracilis Klebs, Circadian rhythm, Cell division cycle, Circadian oscillator

※为通讯作者