慢性阻塞性肺疾病患者抗菌肽LL—37表达水平的检测及意义

宋亚茹　李荣凯　翟成凯

[摘要] 目的 检测抗菌肽LL-37慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者血清中和诱导痰中的表达水平及其在COPD发病中的作用。 方法 选择27例符合标准的稳定期COPD患者（COPD稳定组），28例符合标准的急性加重期COPD患者（COPD急性加重组）及24例健康对照者（自2014年1～8月），应用ELISA法检测血清中和诱导痰中LL-37的含量，由定量数据分析其与FEV1%和SGRQ 分数的直线相关关系。 结果 与健康对照组相比，COPD稳定组和COPD急性加重组诱导痰中LL-37的含量均明显升高（P<0.01），三组之间血清中LL-37的含量无明显差异（P>0.05）。COPD稳定组和COPD急性加重组诱导痰中LL-37的水平与FEV1%呈负相关（P<0.05或P<0.01），而与SGRQ 分数正相关（P<0.05或P<0.01）。 结论 COPD患者诱导痰中LL-37含量升高，且其表达水平与FEV1%和SGRQ 分数有相关性，LL-37可能在COPD的发病中发挥重要作用。

[关键词] 慢性阻塞性肺疾病；LL-37；圣乔治呼吸问卷分数；炎症

[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）32-0008-03

[Abstract] Objective To examine the concentrations of LL-37 in sera and induced sputum from chronic obstructive pulmonary diseases（COPD） patients and to access the role of LL-37 in the pathogenesis of COPD. Methods The LL-37 levels were determined in sera and induced sputum from twenty-seven patients with stable COPD（SCOPD group）， twenty-eight patients with acute exacerbation of COPD（AECOPD group）and twenty-four healthy controls （from Jan to Aug 2014）by ELISA， and then the linear correlations with FEV1% and SGRQ scores were analyzed using quantitative data. Results Compared with healthy control group， the levels of LL-37 in induced sputum were markedly higher in SCOPD group and AECOPD group（P<0.01）. However， the levels of LL-37 in sera were no difference among these three groups（P>0.05）. Furthermore， the LL-37 levels in induced sputum negatively correlated with FEV1% in both SCOPD group（P<0.05）and AECOPD group（P<0.01）. On the contrary，the LL-37 levels in induced sputum positively correlated with SGRQ scores in both SCOPD group（P<0.05） and AECOPD group（P<0.01）. Conclusion The expression levles of LL-37 are increased in induced sputum from COPD patients compared with healthy controls，and correlated with FEV1% and SGRQ scores in COPD patients， suggesting that LL-37 may play an important role in the pathogenesis of COPD.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary diseases； LL-37； SGRQ scores； Inflammation

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种持续存在的以不完全可逆的气流受限为特征的慢性呼吸道疾病，近年来的研究表明，气道局部浸润的固有免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞活化后释放的炎症介质和蛋白酶成分在COPD的致病过程中扮演重要角色[1，2]，然而精确的发病机制尚未完全阐明。内源性抗菌肽是机体固有免疫系统的重要组成部分，在人类已经鉴定出十多种抗菌肽，而防御素家族和Cathelicidins家族是机体最重要的内源性抗菌肽。到目前为止，LL-37是Cathelicidins家族的唯一成员[3]。LL-37具有光谱抗菌活性，参与抵抗和杀伤革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌和病毒等，还可以中和革兰阴性菌细胞壁的脂多糖内毒素[4-5]。然而，LL-37在人类COPD患者的表达及其重要性尚不清楚。

1 对象与方法

1.1 研究对象

COPD组：病例收集自2014年1～8月在新乡市第一人民医院呼吸科住院的COPD患者55例，其中男42例，女13例，病例入选标准均符合中华医学会呼吸病学分会制定的COPD诊断标准[6]。病例组又分为稳定期27例和急性加重期28例。健康对照组：于新乡市第一人民医院体检中心选择无心肺疾病，且近期无呼吸道感染史，肺功能正常的健康志愿者24例，其中男17例，女7例。所有入选者均知情并签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

肺功能测定：所有受试对象的肺功能均在同一肺功能检测医师指导下使用德国耶格肺功能仪测定，肺功能指标包括第一秒用力呼气容积（FEV1）占预计百分比（FEV1% pred）和第一秒用力呼气容积占用力肺活量（FVC）的百分比（FEV1/FVC（%））等。受试对象的健康状况使用St.George's呼吸调查表（St.George's Respiratory Questionnaire，SGRQ）评估[7，8]，SGRQ的评估分数范围是0～100分，分数越低表示健康状况越好。

1.3 检测指标

1.3.1 血液标本和诱导痰标本收集 所有受试对象均于清晨空腹抽取外周静脉血5 mL，凝固离心后小心吸取上清液即血清冻存于-80℃冰箱。受试对象先吸入沙丁胺醇200 μg，20 min之后通过超声喷雾器吸入3%高渗生理盐水，随即收集诱导出的痰液并称重，粘液稀释离心后吸取上清液冻存于-80℃冰箱，待检测。

1.3.2 LL-37的测定 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中和诱导痰中LL-37的含量，严格按照试剂盒（上海佳和生物科技有限公司）说明书操作。

1.4 统计学处理

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数差异采用双侧非配对t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Spearman 秩相关分析。所有分析均应用GraphPad Prism 5.0统计学软件进行，所有统计结论采用0.01与0.05两概率界值。

2 结果

2.1 三组间临床资料分析

三组研究对象的临床资料特征见表1，与健康对照组相比，COPD稳定组和COPD急性加重组均存在不同程度的气流受限，肺功能检测相关指标FEV1%pred和FEV1/FVC差异有统计学意义（P<0.01）。另外，COPD稳定组和COPD急性加重组的吸烟指数明显高于健康对照组（P<0.05或P<0.01），SGRQ亦明显高于健康对照组（P<0.01）。而各组在年龄构成方面差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 血清中和诱导痰中LL-37的表达变化

健康对照组与COPD稳定组血清中LL-37的水平无明显变化[（291.8±15.52）pg/mL vs （282.9±17.36）pg/mL，P>0.05]，与COPD急性加重组血清中LL-37的水平亦无明显变化[（291.8±15.52）pg/mL vs （274.6±17.44）pg/mL，P>0.05]，见图1。与健康对照组相比，COPD稳定组诱导痰中LL-37水平明显升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，COPD急性加重组诱导痰中LL-37的水平也显著升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （9.5±0.45）ng/mL，P<0.001]。急性加重组诱导痰中LL-37水平高于稳定组，差异有统计学意义[（9.5±0.45）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，见图2。

2.3 LL-37与FEV1%和SGRQ的相关性分析

相关性分析结果显示：COPD稳定组诱导痰中LL-37水平与肺功能指标FEV1%负相关，相关系数r=-0.432（P<0.05）；急性加重组诱导痰中LL-37的水平亦与肺功能指标FEV1%负相关，相关系数r=-0.562（P<0.01），见图3。此外，COPD稳定组和急性加重组诱导痰中LL-37的水平与SGRQ均呈正相关关系，相关系数分别为r=0.459（P<0.05）和r=0.669（P<0.001），见图3。

3 讨论

内源性抗菌肽是机体固有免疫系统的重要组成部分，在抗感染免疫过程中发挥重要作用。LL-37首次从骨髓细胞中发现，是人类Cathelicidins家族的唯一成员[9]，LL-37分布广泛，主要由局部固有免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞和局部上皮细胞分泌释放[2，3]。然而LL-37在人类COPD患者中的表达及重要性尚未研究。在本项研究中，为探讨LL-37在COPD致病过程中的可能作用，我们首先检测LL-37在COPD患者血清中和诱导痰中的表达水平，接着分析LL-37的表达水平与肺功能相关指标的相关性。

COPD稳定组和COPD急性加重组诱导痰中LL-37的水平与健康对照组相比显著升高，并且COPD急性加重组高于COPD稳定组，造成这种差异的原因可能是气道炎症应答的不同状态所致。一般情况下，急性加重期同时伴有流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌感染，相对于稳定期，这种感染会进一步诱发局部炎症应答，LL-37水平分泌增加可能做为一种反馈机制抑制此种炎症应答。免疫组化结果显示LL-37主要表达于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺部浸润的中性粒细胞和巨噬细胞等炎细胞[10]，推测这些细胞是导致LL-37水平升高的重要来源。COPD患者诱导痰中LL-37的异常升高不仅仅是局部免疫细胞浸润数量的增加导致，而是于炎症环境中多种细胞共同参与交互作用调节的结果。我们进一步分析了LL-37与肺功能指标FEV1%和SGRQ的相关性，重要的是，发现LL-37的水平与FEV1%存在明显的负相关，提示LL-37的表达水平可以在一定程度上预测肺功能的状况。此外，LL-37的水平与SGRQ存在明显的正相关，我们建议采用LL-37和SGRQ双重指标可能更能反映COPD的疾病严重程度。

总之，这些研究结果提示LL-37可能在COPD的发病过程中发挥重要作用，LL-37发挥作用的机制以及能否用于临床诊断和治疗COPD有待于进一步研究。

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（收稿日期：2015-08-31）