荞麦七中黄酮类物质的抗氧化活性研究

同晓娟，王晓梅，2，党 曼，张元君，刘 婷，赵立芳，2

（1.宝鸡文理学院化学化工学院，陕西宝鸡721013；2.宝鸡文理学院陕西省植物化学重点实验室，陕西宝鸡721013）

研究表明，蓼科植物具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抑制α－葡萄糖苷酶、调节血脂等生理活性［1－3］，其化学成分主要是含挥发油、黄酮类、蒽醌类、萜类及芪类等的化合物［4］。荞麦七为蓼科植物翼蓼Pteroxygonum giraldiiDamm.et Diels的干燥块根，是著名的太白山“七药”之一，是陕西民间广为使用的一种草药，具有凉血止血、除湿解毒的功效，民间用以治疗痢疾、崩漏、腰腿痛、疔疮、狂犬咬伤等症［5］。

荞麦七中化学成分主要是含黄酮类、酚酸、三萜等的化合物［6－9］。目前，关于荞麦七化学成分的分离研究报道较多，而活性方面的研究较少。谭苹等［10］发现荞麦七对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度达到1∶128，与黄连相当，对福氏痢疾杆菌和宋内氏痢疾杆菌的最低抑菌浓度达到1∶64。作者在此对荞麦七不同溶剂提取物中黄酮类物质的抗氧化活性进行研究，拟为荞麦七中抗氧化黄酮类物质的进一步提取分离奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

荞麦七，购于秦岭北坡，经陕西中医学院胡本祥教授鉴定为荞麦七；硅胶（200～300目）、薄层层析板，青岛海洋化工厂分厂。

二氯化锆、枸橼酸、二甲基亚砜、三氯乙酸、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、邻二氮菲、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、双氧水、硫酸亚铁等均为分析纯。

722N（棱光）型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；RE－52AA 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KQ5200E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；SHB－Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荞麦七不同溶剂提取物的制备

将干燥的荞麦七粉碎后，称取400g，分别用2倍量的氯仿、95%乙醇、60%乙醇浸泡72h，将3种浸液分别进行抽滤旋蒸，得到氯仿粗提物（A）、95%乙醇粗提物（B）、60%乙醇粗提物（C）；再依次用乙酸乙酯和正丁醇分别对A、B、C 进行少量多次萃取，得到氯仿－乙酸乙酯提取物（A－a）、氯仿－正丁醇提取物（A－b）、95%乙醇－乙酸乙酯提取物（B－a）、95%乙醇－正丁醇提取物（B－b）、60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）、60%乙醇－正丁醇提取物（C－b）。

1.2.2 黄酮类物质的鉴定

1）盐酸－锌粉反应

取9种提取物的少量乙醇溶液，加入少许锌粉，振摇，滴加几滴浓盐酸，1～2min内（必要时微热）即可显色，观察升起的泡沫的颜色。

2）锆盐－枸橼酸显色反应

取9种提取物的少量甲醇溶液，加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，观察溶液的颜色变化；再加入2% 枸橼酸甲醇溶液，记录颜色变化。

1.2.3 羟基自由基清除率的测定

由于氯仿提取物（A、A－a、A－b）较少，故未进行相关的抗氧化活性检测。

分别配制浓度为2.0 mg·mL－1的B、B－a、B－b、C、C－a、C－b。按表1 依次加入试剂与提取物，分别配制不同实验组，于37 ℃水浴60 min，以pH 值为7.4的PBS缓冲溶液作为参比，测定其在536nm 处的吸光度。按式（1）计算羟基自由基清除率：

式中：A1、A2、A3、A4分别为损伤度、未损伤度、样品组、样品本体组的吸光度。

表1 羟基自由基清除率测定实验加样表／mLTab.1 Sample table for hydroxyl free radical scavenging rate determination experiment／mL

1.2.4 超氧阴离子自由基抑制率的测定

1）自氧化的测定

分别移取Tris－HCl缓冲溶液3.6 mL、蒸馏水4.0mL，加入25 ℃预热的邻苯三酚0.2 mL，立即混匀。以Tris－HCl缓冲溶液作参比，在325nm 处测定吸光度。每30s读一次数，以吸光度稳定所需的时间和数值作为样品测定时的空白组数据。

2）提取物的测定

分别配制浓度为2.0mg·mL－1的B、B－a、B－b、C、C－a、C－b。按表2 加入试剂与提取物，分别配制空白组、样品组、样品本体组，测定其在325nm 处的吸光度，待空白组吸光度达到稳定时开始读数。按式（2）计算超氧阴离子自由基抑制率：

式中：A1、A2、A3分别为空白组、样品组、样品本体组的吸光度。

表2 超氧阴离子自由基抑制率测定实验加样表／mLTab.2 Sample table for superoxide anion free radical inhibition rate determination experiment／mL

1.2.5 还原力的测定

分别取pH 值为6.6 的磷酸缓冲溶液2.5 mL、1%铁氰化钾2.5mL于6支试管中，加入浓度为0.02 mg·mL－1的B、B－a、B－b、C、C－a、C－b提取液1mL，于50 ℃水浴锅中恒温20 min后，加10%三氯乙酸2.5 mL，混匀，移入离心管中，3 000r·min－1离心10 min，取上清液2.5mL，再加蒸馏水2.5mL、0.1%三氯化铁0.5mL，混匀，室温放置10min，测定700nm处吸光度。以pH 值为6.6的磷酸缓冲溶液为参比，平行测定3次。

1.2.6 提取物浓度对抗氧化活性的影响

分别配制浓度（mg·mL－1）为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0的C－a溶液，按1.2.3 方法测定羟基自由基清除率、按1.2.4方法测定超氧阴离子自由基抑制率；分别配制浓度（mg·mL－1）为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06的C－a溶液，按1.2.5方法测定还原力，考察提取物浓度对抗氧化活性的影响。

2 结果与讨论

2.1 黄酮类物质的鉴定结果（表3）

表3 盐酸－锌粉反应与锆盐－枸橼酸显色反应结果Tab.3 Results of hydrochloride－zinc powder reaction and zirconium salt－citrate chromogenic reaction

由表3可知：盐酸－锌粉反应中提取物B、B－a、B－b、C、C－a、C－b均出现紫色，而提取物A、A－a、A－b无明显变化，表明提取物B、B－a、B－b、C、C－a、C－b中均含有黄酮类物质，其中提取物B－a、C－a紫色较深，说明乙醇－乙酸乙酯提取物中的黄酮类物质较多；锆盐－枸橼酸显色反应表明提取物A、A－a、B 和C－a中含有3－羟基黄酮类物质，提取物B－a和C 中含有5－羟基黄酮类物质。上述结果表明，荞麦七提取物中含有3－羟基及5－羟基等其它黄酮类物质。

2.2 荞麦七不同溶剂提取物的羟基自由基清除率（图1）

图1 荞麦七不同溶剂提取物的羟基自由基清除率Fig.1 Hydroxyl free radical scavenging rate of root of Pteroxygonum giraldii Damm.et Diels extracted by different solvents

由图1可知，荞麦七不同溶剂提取物的羟基自由基清除率都达到30%以上，其中以60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）的羟基自由基清除率最高，达到67.78%。

2.3 荞麦七不同溶剂提取物的超氧阴离子自由基抑制率

在弱碱性条件下，邻苯三酚自氧化反应产生超氧阴离子自由基和有色中间产物，该有色中间产物在325nm 处有特征吸收，当加入超氧阴离子自由基清除剂时，溶液在325nm 处吸收减弱。实验发现，邻苯三酚的吸光度数据在12min后达到稳定状态，此时的吸光度为0.157，即空白组A1为0.157。

图2为荞麦七不同溶剂提取物的超氧阴离子自由基抑制率测定结果。

由图2可以看出，荞麦七不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基都有一定的抑制作用，且抑制率因所含黄酮类物质的种类和含量的不同而存在差异，其中60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）的超氧阴离子自由基抑制率最高，为60.34%。

图2 荞麦七不同溶剂提取物的超氧阴离子自由基抑制率Fig.2 Superoxide anion free radical inhibition rate of root of Pteroxygonum giraldii Damm.et Diels extracted by different solvents

2.4 荞麦七不同溶剂提取物的还原力（图3）

图3 荞麦七不同溶剂提取物的还原力Fig.3 Reducing capacity of root of Pteroxygonum giraldii Damm.et Diels extracted by different solvents

由图3可以看出，荞麦七不同溶剂提取物均有一定的还原力且差异较小，提取物B－a、B－b、C 和C－a的还原力相近，都在0.5左右，60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）的还原力最高，达到0.542。

2.5 提取物浓度对抗氧化活性的影响

以提取物C－a为例，考察提取物浓度对抗氧化活性的影响，测定了不同浓度提取物C－a的羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基抑制率和还原力，结果见图4。

由图4可看出，随着提取物C－a浓度的增大，羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基抑制率、还原力都显著升高。表明，提取物C－a中黄酮类物质的抗氧化活性与其浓度存在一定的线性关系。

3 结论

对荞麦七不同溶剂提取物中的黄酮类物质通过化学模拟体系进行了抗氧化活性测试，发现其对羟基自由基具有清除作用，对超氧阴离子自由基具有抑制作用，并且具有一定的还原力。说明荞麦七中的黄酮类物质具有抗氧化活性，但黄酮类物质的种类和含量不同，其抗氧化活性也存在差异，其中60%乙醇－乙酸乙酯提取物中的黄酮类物质的抗氧化活性最高，且随浓度的增大而升高。该研究为荞麦七黄酮类抗氧化活性物质的进一步分离奠定了基础。

图4 提取物C－a浓度对抗氧化活性的影响Fig.4 Effect of concentration of extract C－a on antioxidation activity

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