克雷伯氏杆菌代谢灵活性分析

（青岛科技大学化工学院，山东青岛266042）

通量平衡分析被广泛应用于分析代谢网络的功能［1］。基于稳态的假设，该方法能够准确预测细胞的最大生长速率并给出一组满足条件的通量分布。但是最大生长速率下的通量分布不止一组，要获得全部的解空间可使用基元模式分析［2］，该方法所得的基元模式个数随代谢网络中反应个数的增加呈指数增加，因此，基因组尺度的代谢网络通过枚举基元模式的方法获得所有通量分布也是不可行的。通量可变性分析可以对基因组尺度的代谢网络进行计算得到目标函数值下每个反应通量值的范围（即通量解空间），该通量解空间的体积可用来衡量微生物的代谢灵活性。

微生物为了生存会利用自身的代谢能力适应不断改变的外界环境，改变内部代谢通量分布。该适应性行为具有多样性但必须满足化学计量学约束，而当菌体的适应性行为只有化学计量学约束，而没有动力学约束和代谢调控约束时，可以利用通量可变性分析对其解空间进行计算，进而衡量菌体的代谢灵活性。西班牙学者San等［3］将菌体代谢灵活性改变的原因分为3部分：内部反应的可变性、交换反应的可变性和生长速率的可变性，并利用基因组尺度的大肠杆菌代谢网络iJO1366，以葡萄糖为底物对这3 个因素的重要性进行了分析。

克雷伯氏杆菌以生物柴油的副产物甘油为底物发酵生产重要化学原料1，3－丙二醇的生物方法［4］近年来已经实现了工业化。许多学者对如何提高1，3－丙二醇产率进行了多方面研究，并取得了相应的成果。曾宏等［5］对甘油脱氢酶的生产工艺进行模拟并进行经济分析；朱晓丽等［6］使用大气压介质阻挡放电等离子体与LiCl进行复合诱变，结合FeCl3和产物耐受的筛选方法获得1，3－丙二醇高产突变菌株；陈琳等［7］以木糖作为发酵过程中的辅助底物与甘油共发酵生产1，3－丙二醇，1，3－丙二醇产率和甘油转化率均得到提高；徐卫涛等［8］通过控制发酵过程中的pH 值提高1，3－丙二醇的产率。以上均是通过改变外部条件来提高1，3－丙二醇产率。目前，还没有学者对克雷伯氏杆菌代谢甘油发酵生长应对外界环境改变的代谢灵活性进行理论分析。鉴于此，作者使用代谢流分析软件COBRA Toolbox，对克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络进行通量平衡分析与通量可变性分析，分别得到内部反应的可变性、交换反应的可变性和生长速率的可变性等3个因素对菌体代谢灵活性的影响程度，通过进一步研究生长速率对菌体代谢灵活性的影响，找到提高代谢灵活性的两个必要条件，从而增强菌体应对外界环境改变的能力，指导菌体实际生长。

1 模型与方法

1.1 克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络

本实验使用Liao等［9］重构的克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络iYL1228，该网络包括1 229个基因、1 658个代谢物、2 262个生物反应，并按照功能将反应划分为62个子系统。在构建该基因组尺度代谢网络时，学者们对84%的底物进行生长模拟，发现其模拟数据与实验数据的错误率低于31%，大部分的错误率集中在0.4%～26.3%之间，显示出良好的一致性，因此可以用该网络进行模拟计算。克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络iYL1228的参考条件见表1。

表1 克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络iYL1228的参考条件Tab .1 Reference conditions of genome－scale metabolic network iYL1228for Klebsiella pneumonlae

1.2 算法

本实验使用的代谢流分析软件COBRA Toolbox（Constraint－based Reconstruction and Analysis）［10－11］是运行在MATLAB环境下的工具包，该工具包结合GUN 线性规划工具（glpk）可对基因组尺度的代谢网络进行通量平衡分析与通量可变性分析。

1.2.1 通量平衡分析

通量平衡分析以生长速率最大为目标函数，利用线性规划找到稳态条件下的通量分布。该线性规划问题用公式描述为：

式中：A为化学计量矩阵，若一个系统有m种代谢物，r个反应，则矩阵就有m行r列；反应通量值v作为列向量；稳态条件下，b为零向量；代表反应i在参考条件下计算出的通量最大值与最小值。

1.2.2 通量可变性分析

通量可变性分析可将可行的解空间量化，在与通量平衡分析相同的约束条件下，通量可变性分析可以将每个反应的最大值与最小值计算出来。该线性规划问题用公式描述为：

其中，相对于参考条件的通量可变性用公式表达为：

有两类反应对通量可变性没有影响，计算Δ时不需要计算，这两类反应是：内部循环反应、通量最大值与最小值相同的反应。其中，后者又分为两类：反应通量值为零的反应和不为零的反应。

2 结果与讨论

2.1 通量可变性的组成及计算

通量可变性来源于3部分：内部反应的通量可变性（Δint）、交换反应的通量可变性（Δext）和生长速率的通量可变性（Δgro）。为计算这3部分数值，分别用vint、vext与vgro表示内部反应的通量值、交换反应的通量值与生长速率的通量值。给定条件下，分别表示最优生长速率、最优生长条件下的交换反应速率。Δint就是在约束条件下的值（图1中a 曲线）。仅固定，那么所计算的Δ（Δint＋ext）就是内部反应固有变化和外部反应变化之和（图1中b曲线）。Δint＋ext减去Δint就是外部反应的变化（Δext）。将约束条件去除，所得到的Δtot就是3个原因导致的通量总变化，此时Δtot＝Δgro＋Δint＋Δext（图1中c曲线）。

图1 通量可变性的组成Fig.1 Composition of flux variability

2.2 底物吸收速率对通量可变性的影响

外部环境的改变会影响通量可变性，进而影响菌体的代谢灵活性。以下就底物（甘油、氧气和氨）的吸收速率对通量可变性的影响进行研究。

2.2.1 甘油吸收速率对通量可变性的影响

有氧条件与无氧条件下，甘油吸收速率对通量可变性的影响如图2所示。

图2 甘油吸收速率对通量可变性的影响Fig.2 Effect of glycerol uptake rate on flux variability

由图2可看出：有氧条件下，甘油吸收速率为0.46 mmol·gDW－1·h－1时能够满足ATP所需的最小能量；无氧条件下，甘油吸收速率为5.44 mmol·gDW－1·h－1时才能满足ATP所需的最小能量。

为了考察超出生理范围甘油吸收速率（10.6 mmol·gDW－1·h－1）的代谢灵活性与生理范围内的规律是否一致，将甘油吸收速率增大到16 mmol·gDW－1·h－1，结果显示，在甘油吸收速率生理范围外，Δint与Δext对代谢灵活性的影响几乎可以忽略不计，Δgro是影响通量可变性的唯一重要因素。

2.2.2 氧气吸收速率对通量可变性的影响（图3a）

图3 氧气吸收速率（a）和氨吸收速率（b）对通量可变性的影响Fig.3 Effect of oxygen uptake rate（a）and ammonia uptake rete（b）on flux variability

由图3a可看出，细胞生长所带来的可变性对代谢灵活性的影响最大，其它2个因素所带来的影响可以忽略不计。

2.2.3 氨吸收速率对通量可变性的影响（图3b）

由图3b可看出：当氨吸收速率大于5.6mmol·gDW－1·h－1时，Δgro依然是影响通量可变性的最主要因素；当氨吸收速率小于5.6 mmol·gDW－1·h－1时，Δint与Δext对代谢灵活性也有重要的影响，其中Δint影响更大。

2.3 碳氮调节机制对通量可变性的影响

在大肠杆菌中，葡萄糖的吸收速率随氮的浮动而被调控［12］，进而影响通量可变性。为此，添加了碳氮调节机制，研究其对克雷伯氏杆菌通量可变性的影响。

图4 碳氮调节机制下，氨吸收速率对通量可变性的影响Fig.4 Effect of ammonia uptake rate on flux variability under coordination of carbon and nitrogen utilization

由图4可知，碳氮调节机制下，Δgro对通量可变性的影响很大，Δint与Δext几乎为零，对通量可变性的影响可以忽略。因此，碳氮调节机制下，生长速率的变化仍然是影响通量可变性的唯一重要因素。

以上结果显示，生长速率的变化是引起菌体代谢灵活性改变的主要原因。

2.4 生长速率对通量可变性的影响

由图2可知，固定甘油吸收速率就能固定Δ和最大生长速率。因此固定菌体的生长速率，就可以得到Δ和的关系曲线（图5中▼曲线），这里的是甘油吸收速率为10.6mmol·gDW－1·h－1时的最大生长速率，vgro为较小甘油吸收速率下的生长速率。甘油吸收速率能够约束生物体的最大生长速率，因此能够影响Δ。另一种约束生长速率的方法就是固定其通量值的上限和下限，而不对外部通量值加以限制。本实验在限制生长速率的范围而没有改变其可以得到的最大生长速率的情况下，考察生长速率对通量可变性的影响，结果如图5所示。

图5 生长速率对通量可变性的影响Fig.5 Effect of growth rate on flux variability

由图5可看出：方形（■）中的vgro代表0），Δ值始终保持在1.0附近而没有变化，说明通量可变性随上限值确定的生长速率值变化不敏感；圆圈（○）中的vgro代表，即参考条件下获得的最大生长速率）；实心圆（●）中生长速率的上下限值相同），这两条曲线显示出几乎相同的变化趋势，Δ值均随着值的增大而减小。

由图5还可看出：要使菌体获得较大的代谢灵活性，首先要提供较大的甘油吸收速率，这样菌体才会有大的生长速率；另外要将生长速率调控至比理想值小的值，即菌体在次优模式下生长。这样克雷伯氏杆菌就可以具备较大的代谢灵活性来应对外界环境的改变。

3 结论

使用COBRA Toolbox软件对基因组尺度的克雷伯氏杆菌代谢网络进行了通量平衡分析和通量可变性分析，将外界环境的改变对菌体代谢灵活性的影响量化，分别计算出通量可变性3个因素数值。结果表明，生长速率的可变性是影响其代谢灵活性的唯一主要因素；并进一步分析了生长速率如何影响代谢灵活性，得到两个必要条件：（1）提供较大的甘油吸收速率供菌体生长；（2）调控菌体至次优模式下生长。这两点可使菌体获得较大的代谢灵活性以应对外界环境的改变。

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