一株嗜碱原油降解细菌的筛选及降解能力研究

蓝 慧，陈 帅，曹林友，邓成刚，王 翀，田 云，卢向阳

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙410128；3.湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙410128）

在石油的勘探、开采、运输、储存及生产加工等过程中漏油事故频繁发生，不仅污染土壤，导致土质恶化，影响植物的生长发育［1］，而且导致水体中的溶氧量下降，影响水生生物的生长繁殖［2］。尤其是石油中的多环芳烃（PAHs）等有毒物质具有强烈的致癌、致畸、致突变性，给人类健康带来巨大危害［3－4］。因此，对石油污染的治理迫在眉睫。

原油是一种以烃类化合物为主的成分复杂的混合物，包括烷烃、环烷烃、芳香烃和沥青质化合物［5－6］。当前，治理石油污染常用的物理方法和化学方法均因费用昂贵及二次污染而受到限制，而微生物法因经济、有效、环保、无二次污染［7－9］，已被广泛应用于石油污染的治理。目前，已经分离到大量的原油降解细菌，如假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、芽孢杆菌属（Bacillus）和不动杆菌属（Acinetobacter）等［10－11］。研究表明，细菌降解原油的能力强于放线菌、真菌及酵母菌。Zhang等［12］分离筛选出一株铜绿假单胞菌DQ8，在柴油浓度为2%时，降解率高达83%，在原油浓度为10%时，降解率为35%～40%。Yu 等［13］分离出2 株石油降解菌Bacillus subtilisSWH－1 和SphingbacteriummultivorumSWH－2，降解率分别为33.9%和46.3%。El－Sheshtawy等［14］分离出2株原油降解菌PseudomonasxanthomarinaKMM 1447 和PseudomonasstutzerivATCC 17588，降解率为30%～50%。

表面活性剂是一类能使溶液体系界面状态发生明显变化的物质，能降低表面张力，提高水溶性［15］。表面活性剂作为乳化剂在石油微生物降解过程中能提高微生物对石油的降解率［16－17］。

作者在此从被原油污染的土壤中筛选出一株嗜碱原油降解菌ODB04，对其进行鉴定及生长条件的优化，并在最佳生长条件下对其降解能力进行研究，为该菌在微生物修复中的应用提供理论基础。

1 实验

1.1 材料与培养基

土壤样品采集于被原油污染的土壤；原油购于中国石化。

LB培养基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂粉15～20g、蒸馏水1 000mL，pH 值7.0～7.2，121 ℃灭菌20min。

无机盐培养基：参照文献［17］。

1.2 原油降解菌的富集、分离与纯化

在装有100mL 无机盐培养基的250mL 三角瓶中，加入5mL土壤样品浸提液，添加1%原油作为唯一的碳源和能源，置于30 ℃、200r·min－1恒温摇床培养一周；取10%的富集培养液转移到已添加1%原油的新鲜无机盐培养基中，置于30 ℃、200r·min－1恒温摇床培养一周，连续培养3次。取最后一次富集培养液，梯度稀释至10－5，涂布于含0.1%原油的LB固体平板培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养48h；挑取平板上的单菌落进行划线分离纯化，最后得到一株原油降解效果明显的细菌，命名为ODB04。

1.3 原油降解菌的鉴定

1.3.1 形态学及生理生化鉴定

通过形态学观察和生理生化实验［18－20］，对细菌ODB04进行鉴定。

1.3.2 16 SrDNA 序列分析

提取细菌ODB04 总基因组DNA，扩增细菌ODB04的16SrDNA。引物设计为：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR 反应体系：5μL 的10×buffer，0.25μL 的Tap DNAase，4μL 的dNTP，引物各2 μL，2μL的模板，总反应体系为50μL。PCR 条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸2 min，共32 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物回收后连接到pMD18－T vector上，经阳性鉴定后送华大基因测序。

1.4 细菌ODB04最佳生长条件的确定

分别测试细菌ODB04在不同NaCl浓度（0、1%、2%、4%、6%、8%）、温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）和pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）条件下的生长情况，每组设3个平行，以确定其最佳生长条件。

1.5 最佳生长条件下的原油降解率

将细菌ODB04接种于LB 液体培养基中35 ℃、200r·min－1摇床振荡培养，待菌株进入对数生长期时，5 000r·min－1离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，再用无菌生理盐水重悬浮，用分光光度计测定OD600＝1.0，备用。

在装有35mL 含0.5 mL 原油无机盐培养基的50mL带盖三角瓶中，加入2mLOD600＝1.0的菌悬液，在最佳生长温度下，200r·min－1摇床振荡培养7d，以不加菌悬液为对照，设3个平行。振荡培养7d后，将培养液全部倒入分液漏斗中，加20mL 石油醚振荡萃取培养液中残留的原油，重复振荡萃取2次，合并萃取液，60 ℃干燥至恒质量，称量，用重量法计算原油降解率。

1.6 最佳生长条件下表面活性剂对原油降解率的影响

在最佳生长条件下，分别测试0.05%（体积分数，下同）的非离子表面活性剂Tween 80和Triton X－100对细菌ODB04原油降解率的影响。以未加表面活性剂为对照，设3个平行。

2 结果与讨论

2.1 原油降解细菌的筛选与鉴定

以原油作为唯一的碳源和能源，通过富集培养，分离筛选到具有原油降解能力的细菌ODB04。对其进行形态学和生理生化鉴定，结果见表1。

表1 原油降解细菌ODB04的生化特征Tab.1 Biochemical characteristics of crude oil－degrading strain ODB04

进一步提取细菌ODB04的总基因组DNA，用于16SrDNA 扩增，电泳图谱见图1。

将细菌ODB04的16SrDNA 序列在NCBI数据库中进行BLAST 比对，结果显示与克雷伯氏菌属有99%的同源性。结合形态学、生理生化和分子鉴定结果，并参考伯杰氏细菌鉴定手册，确定原油降解细菌ODB04属肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）。

2.2 细菌ODB04最佳生长条件的确定

不同的NaCl浓度、温度、pH 值等会影响原油的物理状态、化学组成和微生物相关代谢酶的活性以及

图1 细菌ODB04总DNA（a）和16SrDNA扩增回收产物（b）的电泳图谱Fig.1 Electrophorograms of total DNA（a）and 16SrDNA amplified fragments（b）of strain ODB04

微生物生长过程中的渗透压，从而影响对原油的降解率。NaCl浓度、温度、pH 值对原油降解细菌ODB04生长的影响见表2。

表2 NaCl浓度、温度和pH 值对原油降解细菌ODB04生长的影响Tab.2 Effect of NaCl concentration，temperature and pH value on growth of crude oil－degrading strain ODB04

由表2 可见：（1）随着NaCl浓度的升高，细菌ODB04的生长受到抑制，在NaCl浓度高于6%后，细菌ODB04 不能生长。因此，确定最佳NaCl浓度为1%～2%。（2）在温度低于25℃或高于45℃时，细菌ODB04的生长受到抑制。因此，确定最佳生长温度为35 ℃。（3）细菌ODB04不能在酸性条件下生长，但是pH 值为11.0时，仍然能够生长，说明该菌对碱性的忍耐性很强。确定最佳pH 值为8.0～9.0。

2.3 表面活性剂对细菌ODB04的原油降解率的影响

在最佳生长条件（NaCl浓度为1%～2%、温度为35 ℃、pH 值为8.0～9.0）下，测定细菌ODB04的原油降解率，考察表面活性剂对原油降解率的影响，结果见图2。

图2 表面活性剂对细菌ODB04的原油降解率的影响Fig.2 Effect of surfactant on degradation rate of crude oil for strain ODB04

由图2可知：（1）培养7d时，未添加表面活性剂的原油降解率为40%，添加0.05%非离子表面活性剂Tween 80的原油降解率为56%，添加0.05%非离子表面活性剂Triton X－100 对原油降解率影响不大。（2）在未添加表面活性剂的情况下，5d内的原油降解率变化不大，可能是由于原油不溶于无机盐培养基，特别是在第2d，可以在无机盐培养基中明显地看到很多小颗粒状的油滴，阻碍了细菌ODB04对原油的降解利用。（3）在添加0.05%非离子表面活性剂Tween 80的情况下，3d 后的原油降解率迅速升高，原因可能是：Tween 80改变了细菌ODB04细胞膜的脂肪酸组成，增加了不饱和脂肪酸的含量，提高了细胞膜的流动性，有利于细菌ODB04 对原油的降解利用，另外Tween 80能减小表面张力，提高原油的水溶性，从而提高原油的生物利用度［21］。（4）0.05%的非离子表面活性剂Triton X－100 可能对细菌ODB04 有毒害作用，因而原油降解率变化不大。

3 结论

以原油作为唯一的碳源和能源，从被原油污染的土壤中分离得到一株嗜碱原油降解细菌ODB04，通过对该细菌的形态学观察、生理生化实验及16SrDNA序列分析，鉴定该菌为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。细菌ODB04的最佳生长条件为NaCl浓度1%～2%、温度35 ℃、pH 值8.0～9.0。在该条件下培养7d，细菌ODB04对原油的降解率为40%，在添加0.05%非离子表面活性剂Tween 80 的情况下，原油降解率高达56%，0.05%非离子表面活性剂Triton X－100 对原油降解率影响不大。表明，细菌ODB04有很高的原油降解率，具有很强的耐碱能力，对丰富微生物资源和生物修复原油污染土壤具有一定的意义。

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