黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌对18种抗生素的耐药性分析

2015-12-28郭嘉红王文生周敬华闫东辉

河北医科大学学报 2015年2期

郭嘉红，王文生，周敬华，闫东辉

(1.河北省大厂回族自治县人民医院检验科，河北大厂065300;2.河北省三河市医院检验科，河北三河065200; 3.河北省永清县人民医院检验科，河北永清065600;4.首都医科大学附属北京友谊医院检验科，北京100050)

郭嘉红1，王文生2，周敬华3，闫东辉4

目的比较黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)在体外药物敏感性试验中对各种药物的耐药性，指导临床合理使用抗菌药物。方法使用生物梅里埃API20NE系统对菌株进行鉴定，用K-B纸片法和微量肉汤稀释法对菌株进行药物敏感性试验，并进行统计学分析。结果黏液型PA对黏菌素、阿米卡星、妥布霉素100.0%敏感，其余抗菌药物的耐药率为2.6%～78.3%;非黏液型PA对复方新诺明100.0%耐药，其余抗菌药物的耐药率为2.6%～96.6%。除黏菌素、阿米卡星外，黏液型PA耐药率均显著低于非黏液型PA(P＜0.05或＜0.01)。结论黏液型PA的体外耐药性明显弱于非黏液型PA，但由于其能产生大量藻酸盐，而在菌体外形成生物膜，因此要加强非黏液型PA的检测，指导临床合理用药。

铜绿假单胞菌;抗生素类;抗药性，细菌

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是非发酵菌之一，为条件致病菌，广泛分布于自然界和医院环境，其易定植、易变异以及多重耐药性的特征，已成为医院内感染的主要致病菌之一［1］。它是院内呼吸道感染的首要病因，在重症监护病房特殊护理的插管患者中尤为严重，病死率在40%～50%。PA可导致院内泌尿道感染、伤口感染、慢性活动性腹膜炎透析患者腹膜炎和菌血症。PA还是儿童和成人艾滋病患者发病和死亡的重要原因。PA从菌落形态可分为黏液型和非黏液型。黏液型PA由于大量产生藻酸盐而在菌体外形成生物被膜，该被膜能使菌体逃逸机体免疫清除和增强对抗菌药物的耐药，一旦感染很难从患者体内清除，是造成肺囊性纤维化的重要病原菌［2］。本研究对临床分离的黏液型PA和非黏液型PA进行鉴定及药敏分析，旨在了解黏液型和非黏液型PA的耐药特征，以便为临床更有效、更合理地使用抗菌药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2010年9月—2013年9月河北省大厂回族自治县人民医院临床送检的各类标本分离出的PA 383株，其中黏液型PA 115株，非黏液型PA 268株。同一患者相同部位重复分离到的相同菌株不作重复计数。

1.2 质控菌株 PA ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922。

1.3 试剂法国梅里埃API20NE鉴定卡，药物敏感性纸片为英国Oxoid公司产品，抗菌药物粉剂购自SigmaAldrich公司，M-H培养基购自天津金章公司。

1.4 细菌鉴定与药敏试验标本送至微生物实验室后，按《全国临床检验操作规程》［3］相应要求接种、分离，获得单个菌落后，经法国梅里埃API20NE鉴定为PA，其菌落形态在麦康凯培养基35℃培养18～24 h，生长为无色、小露滴样、边缘不规则小菌落，48～72 h长大而融合、黏稠、胶冻样，用接种环不易挑起的无金属光泽、无特殊气味的菌落为黏液型PA。非黏液型PA菌落呈灰绿色，大小不一，扁平湿润，边缘不规则，呈伞状伸展，有金属光泽。采用微量肉汤稀释法和K-B纸片扩散法进行药敏试验［4］。用K-B纸片扩散法对黏液型PA进行药敏试验时应延长孵育时间至48 h。结果判定按2010年美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准进行解释。

1.5 统计学方法应用细菌耐药监测软件WHONET 5.6进行数据统计，组间耐药性比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定结果 268株非黏液型PA中，来自痰标本检出率最高221株(82.5%)，来自脓液及分泌物31株(11.6%)，来自咽拭子8株(3.0%)，来自尿液6株(2.2%)，来自血液2株(0.7%)。115株黏液型PA中，来源于痰液109株(94.8%)，来源于脓液及分泌物4株(3.5%)，来源于其他2株(1.7%)。

2.2 药敏结果 268株非黏液型PA对黏菌素、阿米卡星耐药性较低，分别为2.6%、3.0%，对妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、庆大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢他啶、美洛培南、亚胺培南、氨曲南耐药率为10.1%～52.2%，对头孢曲松、呋喃妥因、头孢呋辛、头孢唑林、复方新诺明耐药率为90.7%～100.0%。115株黏液型PA对黏菌素、阿米卡星、妥布霉素、美洛培南药率为0.0%。对哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、庆大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢他啶、亚胺培南耐药率也很低为2.6%～10.4%，对头孢曲松、呋喃妥因、头孢呋辛、头孢唑林、复方新诺明耐药率为37.4%～78.3%。除黏菌素、阿米卡星外，非黏液型PA对各种药物的耐药率明显均高于黏液型PA，二者比较差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01)。见表1。

表1 黏液型与非黏液型PA对18种抗生素耐药率的比较(株数，%)

3 讨论

PA是引起弥漫性泛细支气管炎、慢性支气管炎、支气管扩张并感染的重要病原菌之一［5］。本研究中268株非黏液型PA中，来自痰标本221株(82.5%)，115株黏液型PA中，来源于痰液109株(94.8%)，与相关文献基本一致［6］。

本研究非黏液型PA对抗生素耐药性较高，其对黏菌素、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、庆大霉素耐药性较低分别为2.6%、3.0%、10.1%、11.2%、15.3%、16.8%，与朱荔清等［7］的研究结果基本一致。黏菌素与细菌细胞膜的磷脂发生作用，增加细胞的通透性并破坏渗透完整性，引起细胞内成分流失，导致细胞死亡。黏菌素仅作用于革兰阴性杆菌，特别是假单胞菌属细菌，治疗期间很少出现耐药性，与其他抗生素无交叉耐药。黏菌素与复方新诺明联用可产生协同抗菌作用，治疗多重耐药假单胞菌属引起的感染。黏菌素通常作为严重的、威胁生命的假单胞菌感染或对所有抗生素耐药病原体引起的革兰阴性菌感染的后备药物，气溶性多黏菌素已成功地治疗了肺囊性纤维化或支气管扩张症患者PA定植或呼吸系统感染。但在临床应用中应注意其不能穿透膜进入胸水、滑液或脑脊液，以及它的神经毒性和肾毒性的不良反应。非黏液型PA对阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、氨基糖苷类抗生素耐药性也较低，为3.0%、10.1%、16.8%。氨基糖苷类抗生素的主要特点是它们对需氧革兰阴性杆菌(包括PA)具有杀菌活性，其通过不可逆结合到细菌30s核糖体亚单位，抑制细菌蛋白合成，在蛋白合成期，氨基糖苷类-细菌核糖体结合物形成，使mRNA转移障碍，导致细胞死亡。虽然庆大霉素和妥布霉素有非常相似的抗菌活性谱，而妥布霉素对PA的抗菌活性更强。庆大霉素和妥布霉素容易被耐药菌产生的同一种修饰酶灭活，因此容易产生交叉耐药。阿米卡星对多数氨基糖苷类修饰酶有抗性，所以常用作庆大霉素和妥布霉素耐药性流行时的选择品种。阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素可作为首选的治疗PA感染推荐药物，但因它们的肾脏毒性、听力或前庭毒性，临床应用受到了局限。非黏液型PA对哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、哌拉西、耐药率分别为11.2%、15.3%、17.9%，它们也可作为治疗PA感染的临床常用药物。左氧氟沙星、环丙沙星、头孢他啶耐药率分别为19.4%、22.4%、24.6%，这些抗生素对PA具有较强的抗菌作用，但随着它们在临床大量、广泛的应用，其耐药性也在逐年增加。氨曲南耐药率为52.2%，它与氨基糖苷类具有体外协同抗菌作用，作为单环类抗生素细菌耐受和接种物效应较少见，临床联合用药效果较好。美洛培南、亚胺培南的耐药率为22.4%、25.0%，与蒋冬香等［8］的研究结果相似。碳青酶烯类抗生素是针对革兰阴性杆菌感染疗效较为可靠且稳定的药物。近年来，由于它们广泛应用于治疗产超广谱β-内酰胺酶革兰阴性杆菌引起的感染，在抗菌药物选择性压力下，使其对PA的敏感性逐年下降，耐碳青酶烯类抗生素开始出现，并逐年增多。细菌耐药性来源于产生了能水解碳青霉烯核的碳青酶烯酶和细菌细胞壁孔道蛋白通道的改变。其同广谱头孢菌素或超广谱青霉素联合应用时，亚胺培南可以表现出体外抗拮作用，其结果是它能诱导Ⅰ组β-内酰胺酶产生。因此，临床用药时避免亚胺培南与上述药物联合应用，以免引起PA产生耐药性。头孢曲松、呋喃妥因、头孢呋辛、头孢唑林、复方新诺明耐药率为90.7%～100.0%，它们对 PA天然耐药［9］。因此，要加强细菌培养与鉴定工作，及时找出病原菌，合理应用抗生素。

黏液型PA是PA自然存在的一种特殊形式，其在细菌表面产生大量黏液，主要成分为多糖藻，从而可以持续定植、形成生物膜。一旦PA形成生物膜，有助于细菌逃逸抗菌药物或宿主防御机制，引起感染持续存在、抗菌药物治疗效果不明显等［10］。非黏液型PA在渗透压较高、氯化钠较多、磷酸盐较少等环境条件下容易转化为黏液型PA［11］。体外药敏试验中，非黏液型PA对抗菌药物的耐药率明显高于黏液型PA。这主要是因为体外药敏试验只测试浮游状态的细菌，不能反映生物膜介导的耐药性，常出现黏液型PA虽然体外药敏试验敏感，但临床体内用药大多无效，造成实验室检测和临床治疗效果之间的矛盾［12］。这是因为细菌生物被膜可阻碍营养物质透过，细菌代谢低下，且抗菌药物不易通过被膜，因而产生耐药性，即使抗菌药物浓度达到很高，仍不能杀灭被膜下的细菌。细菌生物被膜还能够避免细菌与免疫细胞及抗体相互作用，抑制吞噬细胞吞噬，产生免疫逃逸，从而使其长期生存。藻酸盐是黏液型PA形成生物被膜的主要成分。体外研究发现，藻酸盐在黏液型PA生物被膜的形成中发挥着重要的作用，故除去生物被膜必须设法减少藻酸盐的合成。大环内酯类抗生素能起到有效抵抗生物被膜的作用。体内的研究发现大环内酯类抗生素能使生物膜的表面形成孔穴，从而使生物膜内部细菌得以暴露，有利于敏感药物进入生物膜内部杀灭细菌。大环内酯类抗生素可使体内藻酸盐免疫复合物逐渐下降，有效地抑制由藻酸盐介导的抗原抗体反应;大环内酯类抗生素尚有免疫调节作用，能有效地增强中性粒细胞对PA生物膜的吞噬作用［13］。本研究显示，黏液型PA体外敏感的抗菌药物较多，除黏菌素、阿米卡星(P＞0.05)外，对其他药物的耐药性明显低于非黏液型PA，二者比较差异有统计学意义(P＜0.01或＜0.05)。黏菌素、阿米卡星对黏液型和非黏液型PA的耐药性差异无统计学意义(P＞0.05)且耐药性较低，可以作为临床经验性用药的首选药物。妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、庆大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢他啶、美洛培南、亚胺培南对黏液型PA耐药率也很低，与非黏液型PA的耐药性差异有统计学意义。但在治疗黏液型PA引起感染时，还必须考虑其存在生物被膜耐药的因素，在临床使用中应与大环内酯类抗生素联合应用从而达到杀菌的目的。在肺囊性纤维化患者肺部感染的晚期，PA可能表现出对所有的抗生素耐药，大剂量的妥布霉素雾化治疗可能有效。体外药敏试验有13.9%～17.4%的黏液型PA株对头孢曲松、呋喃妥因、头孢呋辛、头孢唑林、复方新诺明敏感，可能与这些菌株的基因发生了突变，也可能与在体外试验中由于黏液型PA的菌落表面覆盖一层厚厚的黏液，致使制作菌液的过程中挑取了大量的黏液而导致实际的菌液浓度偏低有关。但由于PA对上述药物天然耐药，因此在治疗时应首先排除此类药物。

总之，通过对黏液型和非黏液型PA耐药性的分析，了解它们的耐药特点，可指导临床正确选择合理的抗生素进行治疗，防止耐药菌的产生。

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