应用荧光定量聚合酶链反应技术快速筛查重症监护室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌定植者

孙 茜，吕志堂，孙雅堃

（1.河北省保定市第一中心医院检验科，河北保定071002;2.河北大学生命科学学院，河北省微生物多样性研究与应用实验室，河北保定071002）

应用荧光定量聚合酶链反应技术快速筛查重症监护室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌定植者

孙 茜1，吕志堂2*，孙雅堃1

（1.河北省保定市第一中心医院检验科，河北保定071002;2.河北大学生命科学学院，河北省微生物多样性研究与应用实验室，河北保定071002）

目的 建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）荧光定量PCR快速检测方法，筛查重症监护室（intensive care unit，ICU）MRSA定植者。方法 采集患者感染部位标本或鼻咽拭子标本，快速提取总DNA后应用荧光定量PCR方法检测标本中nuc和mecA基因，对于双阳性结果报MRSA阳性，采取早期干预措施。结果 建立的荧光定量PCR方法灵敏度高（4 CFU/反应）、快速、准确率100%。采取筛查和干预降低了ICU的MRSA感染率。结论 应用荧光定量PCR对MRSA早期筛查及干预，有助于早发现、早诊断、早隔离、早治疗，可有效防止或终止MRSA导致的医院感染暴发流行。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;聚合酶链反应;筛查

自上世纪60年代初发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）以来［1］，MRSA经历了快速进化和流行扩张，在全球范围内已从医院向社区扩散并迅速发展为社区感染最重要的病原菌［2］。根据卫生部全国细菌耐药监测网2006—2007年对84家医院的统计结果显示，国内医院MRSA的感染率占院内感染的56%左右，个别医院甚至高达70%，而重症监护室（intensive care unit，ICU）中MRSA的感染率较普通病房高出20%～30%，ICU已成为MRSA感染防控的重点［3］。探讨MRSA感染高危人群、高危因素的防控措施，降低MRSA感染率，终止MRSA院内传播，避免医院感染暴发流行事件发生，确保医疗安全已成为大多数研究者的共识［4－6］。本研究旨在建立快速、高灵敏度的MRSA定量PCR检测方法，以期为ICU的MRSA防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 菌株及标本 2009—2011年河北省保定市第一中心医院分离并经生理生化实验鉴定的实验用MRSA菌株135株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillinsensitive S.aureus，MSSA）菌株83株，根据CLSI2011年标准区分。2012年1—12月共筛查临床标本231份，均取自入住ICU前患者感染部位或鼻咽拭子。所有实验均以金黄色葡萄球菌ATCC 33591作为 MRSA对照菌株，以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为MSSA对照菌株。

1.2 DNA提取 首先将标本置于1.5 mL离心管中，加入400μL TE缓冲液（10 mmol/L Tris.Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0），涡旋振荡1 min（纯培养不用该步骤），将悬液12 000r/min离心5 min，弃上清，应用百泰克细菌基因组DNA提取试剂盒（溶液型）提取，其中酶解步骤加入20 U的溶葡球菌酶（上海生工），最后溶解DNA改用20μL DNA溶解液，其余步骤按说明书进行操作。

1.3 荧光定量PCR引物、探针及扩增方法 根据文献报道的金黄色葡萄球菌nucA基因扩增引物Fnuc：5＇－GCGATTGATGGTGATACGGT－3＇，Rnuc：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC－3＇［7］。进一步优化引物序列和特征参数后使用的nucA基因扩增引物 Fnuc＇：5＇－GCGATTGATGGT－GATACKGT－3＇，Rnuc＇： 5＇－AGCCAAGCCTTGA－CGAACT。 采 用UltraSYBR Mixture（CWBIO）50μL体系，DNA模板用量5μL，扩增程序为预变性94℃ 10 min，变性94℃10 s，复性59.2℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，40个循环，溶解曲线59.2～94℃。

mecA基因扩增方法参考文献中描述的方法进行，扩增引物 mecA－F：5＇－CAAGATATGAAGTGGTAAATGGT－3＇ 和 mecA－R： 5＇－TTTACGACTTGTTGCATACCATC－3＇;探针为 mecA－HP－1：5＇－CAGGTTACGGACAAGGTGAAATACTG ATT－［fam］3＇和 mecA－HP－2： 5＇ ［Red 640］－ACCCAGTACAGATCCTTTCAATCTATAGCG－p3＇。 采 用GoldStar TaqMan Mixture（CWBIO）50μL体系，DNA模板用量5μL，扩增程序为预变性95℃ 10 min，变性95℃ 10 s，复性50℃ 10 s，延伸72℃ 20 s，45个循环，溶解曲线45～75℃［8］。以上扩增均在Bio－Rad CFX96荧光定量PCR仪上完成。

1.4 干预措施 对于确诊MRSA感染者及携带者，及时采取隔离措施，加强对其他监护患者，特别是抵抗力低下患者的保护性措施。医务人员相对固定，专人诊疗护理。此外，采取加强环境卫生干预、严格无菌操作等措施［5］。

2 结 果

2.1 nuc扩增引物优化结果 经与GenBank中已注册的核酸序列Blast比对及实验验证，优化得到nuc基因定量 PCR扩增特异引物 Fnuc＇：5＇－GCGATTGATGGTGATACKGT－3＇ 和 Rnuc＇： 5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAA－3＇。

2.2 标准曲线的制作 将已知浓度为3.9×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，稀释梯度分别为10－1～10－5，然后用改进的nuc基因特异引物和文献报道的mecA引物进行荧光定量PCR［9］。扩增结束后，根据每个反应体系中DNA对应的金黄色葡萄球菌菌落形成单位（colony forming test，CFU）和反应的Ct值制作标准曲线。得到nuc基因定量PCR标准曲线方程为： y=－3.563x+38.39（R2=1.000）（其中y表示Ct值，x表示lg CFU）;得到mecA基因定量PCR标准曲线方程为：y=－3.623x+40.11（R2=0.997）（其中y表示Ct值，x表示lg CFU），线性良好。实验条件下MRSA菌株纯培养的检测下限为4 CFU/反应体系。

2.3 临床分离菌株验证结果 分别对本医院2009—2011年分离得到的83株MSSA菌株和135株MRSA菌株进行nuc基因和mecA基因荧光定量PCR检测，结果所有菌株均为 nuc阳性，且所有MSSA菌株均为mecA阴性，所有MRSA菌株均为mecA阳性，结果100%相符，说明本研究改进的方法是成功的。

2.4 临床标本筛选结果 2012年1—12月，采用定量PCR法筛查了231份取自入住ICU前患者感染部位或鼻腔拭子的临床标本，并对相应标本进行常规分离鉴定和药敏测定。定量PCR检测中对于双阳性结果者报MRSA阳性，从感染部位取标本，3种检测方法差异无统计学意义（P＞0.05），从鼻咽拭子取标本，定量PCR检测阳性率高于其他2种方法（P＜0.05），见表1。

表1 定量PCR和常规分离培养法筛选MRSA感染结果比较Table 1 Comparison in MRSA infection screening between quantitative PCR and conventional isolated cu lture （株数，%）

2.5 ICU的MRSA防控效果分析 自2012年6月起，我院ICU根据MRSA定量PCR筛查结果，采取了相应防控措施，通过持续1年的统计，我院ICU的MRSA院内感染发生率由之前的9.6例/1 000例患者降低至4.2例/1 000例患者，效果明显;同时有助于提高ICU的床位利用率。

3 讨 论

尽管医院感染管理和消毒隔离制度不断完善且常规监控措施已实施，而MRSA感染发病率并未下降，已成为各医院面临的一大难题。虽然少数研究者认为对ICU患者主动筛查对降低MRSA感染没有意义［9］，但由于MRSA定植者可以将MRSA传染给他人，且MRSA定植者较非定植者更容易发生MRSA感染，多数研究者认为筛查MRSA定植者并进行干预，对于降低MRSA感染的发病率，终止MRSA在院内的传播，避免医院感染暴发流行事件发生具有重要意义［4－6］。然而，传统检测MRSA的方法都是基于培养的方法，耗时长达48～72 h［10］，对MRSA防控指导意义不大，应用PCR技术快速检测筛查MRSA携带者已成为发展趋势［11－13］。目前，使用快速煮沸裂解法和商业化的DNA提取试剂盒［13－14］即使经过样品富集，其荧光定量PCR检测下限也在10 CFU/拭子左右，而且对于富集分离阳性的标本有可能漏检［15］，应用普通PCR方法检测灵敏度则在103 CFU左右［7］。

本研究经与GenBank中已注册的核酸序列Blast比对之后发现：文献中报到的nuc正向引物Fnuc：5＇－GCGATTGATGGTGATACGGT－3＇［7］的覆盖度不高，与之匹配的大部分金黄色葡萄球菌nuc基因在引物序列的第18位碱基不是G而是T。也就是说，现有引物在检测中可能遗漏部分已知金黄色葡萄球菌菌株。因此，我们在第18位设计兼并碱基K（G或T），以提高引物的覆盖度，减少漏检。此外，反向引 物 Rnuc：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC－3＇［8］和部分菌株3＇末端不匹配，经过改进得到Rnuc＇：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAA－CTAA－3＇，不仅与目的菌株的匹配程度提高，而且Tm值为63.74℃，与正向引物更接近，改善了扩增效果。

改进的方法较文献报道的方法检测灵敏度有较大提高［13－14，16］，可能是在细胞裂解时使用溶葡球菌酶，提高了DNA提取效率的结果。总体上，定量PCR法对MRSA的检出率与富集分离法相当，对于鼻咽拭子中MRSA的检出率要显著高于直接分离法;即使与富集分离法相比，定量PCR法对鼻腔拭子的检出率也略高于富集分离法（P＜0.05）。定量PCR法不仅灵敏，而且整个过程只需5～7 h，较常规方法的48～72 h的效率大大提高。

针对金黄色葡萄球菌难破壁的特性，在DNA提取时加入溶葡萄球菌酶有助于提高DNA提取效率，本研究改进的nuc引物降低引物覆盖度不高而导致的漏检，从而提高了检测灵敏度;根据nuc基因和mecA基因定量PCR筛查MRSA感染者和携带者，可实现MRSA患者（携带者）早发现、早诊断，结合采用及时隔离、强化卫生干预等措施，对于降低MRSA院内感染具有重要意义。

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（本文编辑：许卓文）

Rapid screening ofm ethicillin resistant Staphylococcus aureus colonised patients in ICU using fluorescent quantitative polymerase chain reaction

SUN Qian1，LV Zhi－tang2*，SUN Ya－kun3
1． Clinical Laboratory，No． 1 Central Hospital of Baoding City，Hebei Province，Baoding 071000，China; 2． College of Life Sciences，Hebei University ＆ Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，Hebei Province，Baoding 071002，China）

Objective To establish the fluorescent quantitative polymerase chain reaction（QPCR）method for screening methicillin resistant Staphylococcus aureus（MRSA）colonised patients of intensive care unit（ICU）.MethodsCollecting the infection specimen or nasal swabs，extracting the DNA，and detecting the nuc gene and mecA gene within the sample by Q－PCR.For the double positive results specimen，MRSA positive was reported and intervening measures were adopted.ResultsThe QPCR method improved in this study was rather quick and showed high sensitivity（4 CFU/reaction）and accuracy（100%）.Q－PCR screen and early infection controlmeasures reduced the MRSA infection rate of ICU.ConclusionEarly screening and intervening of MRSA are helpful to early detection，diagnosis，quarantine and treatment，and also can effectively prevent or stop hospital infection outbreak caused by MRSA.

methicillin－resistant staphylococcus aureus;polymerase chain reaction;screening

R735.7

A

1007－3205（2015）03－0309－04

2014－04－23;

2014－04－25

孙茜（1972－），女，河北保定人，河北省保定市第一中心医院副主任医师，医学硕士，从事临床检验学研究。

*通讯作者。E－mail：lzt325@126.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.018