高效液相色谱法测定乌金胶囊中毛蕊异黄酮的含量

·论著·

高效液相色谱法测定乌金胶囊中毛蕊异黄酮的含量

王慧，李洋，吕昉，凌水花，黄玉凤，张国庆(第二军医大学东方肝胆外科医院药材科，上海 200438)

[摘要]目的建立高效液相色谱法测定乌金胶囊中毛蕊异黄酮含量。方法色谱柱为ZORBA Bonus-RP (4.6 mm×260 mm，5 μm)分析柱，流动相乙腈-水(含0.1%甲酸)梯度洗脱，柱温25 ℃，检测波长为260 nm，流速1.0 ml/min，进样量10 μl。结果毛蕊异黄酮在7.4~117.6 μg/ml(r=1.000)浓度范围内呈良好线性关系，其回归方程为Y= 34.002 X-3.451 2，回收率为95.24% (RSD=2.10%)。6批乌金胶囊中异黄酮含量在9.26～23.14 μg/g之间。结论该方法简便、快速、准确，可用于乌金胶囊的质量控制。

[关键词]高效液相色谱法；毛蕊异黄酮；含量测定；乌金胶囊

[作者简介]王慧，硕士，主管药师.E-mail:wang_ehbh@126.com

[通讯作者]张国庆.E-mail:guoqing_zhang91@126.com

[中图分类号]R917[文献标志码]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.013

[收稿日期]2014-01-27[修回日期]2014-04-11

Determination of calycosin contents in Wujin capsule by HPLC

WANG Hui，LI Yang，LÜ Fang，LING Shuihua，HUANG Yufeng，ZHANG Guoqing(Department of Pharmacy，Eastern Hepatobilliary Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200438，China)

Abstract[]ObjectiveTo explore method for determination of calycosin contents in Wujin capsule by HPLC.MethodsThe sample was studied on ZORBA Bonus-RP (4.6 mm×260 mm，5 μm) column，the mobile phase consisted of acetonitrile and H2O-0.1% HCOOH (gradient elution),the temperature of column was 25 ℃,the UV detection wavelength was set at 260 nm,flow speed was 1.0 ml/min and injection volume was 10 μl.ResultsThe calycosin calibration curve was at the range of 7.4-117.6 μg/ml (r=1.000)，with their regression function being Y=34.002 X-3.451 2.The recovery of calycosin was 95.24% (RSD=2.10%).6 batches of Wujin capsule calycosin contents were 9.26-23.14 μg/g.ConclusionHPLC was an accuracy and simple method for determining the content of calycosin in Wujin capsule.

[Key words]HPLC；calycosin；determination；Wujin capsule

乌金胶囊是第二军医大学附属东方肝胆外科医院自制制剂，处方由乌骨藤、郁金、黄芪、延胡索、山楂五味中药组成，具有清热解毒、活血化瘀、益气止痛之功效，临床用于痈肿痉毒、痰湿积聚、血瘀气滞、胸肋胀痛诸症及肝癌的辅助治疗。其中黄芪作为乌金胶囊的臣药，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌之功效[1]，国内外文献报道，黄酮类和三萜皂苷类化合物为黄芪的主要活性成分[2]，在抗肿瘤、抗炎抗菌等方面均有较好的药理作用[3]，还有研究证明，黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞具有明显的抑制作用[4]，同时毛蕊异黄酮还具有植物雌激素作用，能显著改善内皮细胞功能障碍[5]。乌金胶囊作为复方制剂，成分复杂，对其中毛蕊异黄酮等有效成分进行含量测定时干扰较大，笔者采用大孔树脂对样品进行除杂和富集，应用高效液相色谱法对黄芪中毛蕊异黄酮成分进行含量测定，为乌金胶囊质量控制的建立提供了科学、可靠的依据。

1仪器和试药

1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Chemstation色谱工作站，D-101大孔吸附树脂(上海骏惠化工有限公司)，SK2200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，METYLER AE240型电子天平，电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)。乌金胶囊由第二军医大学东方肝胆外科医院制剂室生产，0.5 g/粒；毛蕊异黄酮对照品(纯度>98%，上海诗丹德生物技术公司)；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，无水乙醇为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1　色谱条件

色谱柱：ZORBA Bonus-RP (4.6 mm×260 mm，5 μm)；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：260 nm；进样量10 μl；流动相：二元梯度洗脱，乙腈(A)， 水(B)(含0.1%甲酸)， 梯度洗脱条件如下：0~10 min，25%~45% A；10~20 min，45%~60% A。

2.2　溶液的制备

2.2.1对照品溶液精密称取毛蕊异黄酮对照品5.88 mg置10 ml 的量瓶中，用甲醇定容，摇匀得浓度为0.588 mg/ml储备液，置4 ℃冰箱保存。

2.2.2供试品溶液取10粒胶囊内容物混匀，精密称取3.00 g于锥形瓶，加60 ml甲醇，超声提取30 min，过滤，滤液通过水浴加热浓缩至近干(60 ℃)，浸膏加5 ml水分散，溶解后上D-101大孔吸附树脂柱富集黄酮类成分，树脂柱用50 ml水洗脱后，继用70%乙醇120 ml洗脱，收集洗脱液并回收溶剂至近干，提取物加3 ml甲醇溶解，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

2.2.3阴性样品溶液以相同处方比例，按乌金胶囊制备工艺制备不含黄芪的阴性样品。

2.3　方法学考察

2.3.1系统适应性按2.1项下条件，以对照品溶液、制剂样品及阴性样品溶液分别进样，见图1，毛蕊异黄酮保留时间13.9 min，制剂中其他成分对待测峰无干扰，分离度大于1.5，理论塔板数大于5 000，对称因子均在0.95~1.05之间。

图1　对照品(A)、供试品(B)和阴性样品(C) HPLC色谱图 1.毛蕊异黄酮

2.3.2检测限及定量限精密量取毛蕊异黄酮对照品溶液适量，以信噪比3:1计，检测限为0.254 μg/ml；以信噪比10:1计，定量限为0.634 μg/ml。

2.3.3标准曲线及线性配制毛蕊异黄酮对照品浓度为7.4、 14.7、 29.4、 58.8、 117.6 μg/ml， 以浓度为横坐标(X)， 色谱峰面积为纵坐标 (Y)进行线性回归， 得回归方程， 毛蕊异黄酮线性回归方程为Y=34.002X-3.451 2，r=1.000， 在 7.4~117.6 μg/ml范围内线性关系良好。

2.3.4精密度取毛蕊异黄酮对照品浓度为29.4 μg/ml溶液在上述色谱条件下重复进样6次。结果毛蕊异黄酮峰面积的RSD为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.3.5重复性取乌金胶囊(批号：20130401)，按“2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液6份，按2.1色谱条件进样，毛蕊异黄酮的平均含量为9.20 μg/g，RSD为2.50%。结果表明该方法重复性良好。

2.3.6稳定性取乌金胶囊(批号：20130401)，按“2.2.2”项下方法制备供试品样品，分别在0、4、8、14、24 h时间间隔，测定毛蕊异黄酮峰面积，RSD<2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7加样回收率取乌金胶囊 (批号20130401)6份，精密称定，每份3.00 g，加入浓度为0.588 mg/ml毛蕊异黄酮对照品0.1 ml，按“2.2.2”项下方法处理样品，按2.1色谱条件进样，计算回收率，毛蕊异黄酮回收率95.24%，RSD为2.10%。

2.4　样品测定

取不同批次乌金胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定峰面积，根据标准曲线计算6批乌金胶囊中毛蕊异黄酮含量，结果见表1。

表1　6批乌金胶囊中毛蕊异黄酮含量测定结果( n=3)

3讨论

3.1　检测对象的选择

2010年版《中国药典》规定黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法[1]，笔者初始对黄芪中几个黄酮类和皂苷类化合物均进行含量测定，实验过程中发现毛蕊异黄酮葡萄糖苷等的含量相对较低，基本达到检测限，因此最终确定毛蕊异黄酮为检测对象来对乌金胶囊进行质量控制。

3.2　大孔吸附树脂条件的优化

乌金胶囊由乌骨藤、郁金、黄芪、延胡索、山楂五味中药组成，成分复杂，杂质干扰较大，D-101大孔吸附树脂是一种聚苯乙烯型非极性树脂，在黄酮的纯化方面已有较多报道。文献表明，其对黄酮类化合物的吸附性能和解吸性能都较好[6]。故本实验选取该树脂对乌金胶囊中毛蕊异黄酮成分进行富集，分别用30%、50%、70%、95%的乙醇解吸，结果70%的乙醇可以将毛蕊异黄酮完全洗脱下来，因此选取70%的乙醇作为洗脱液。D-101大孔吸附树脂技术具有重复性高、杂质干扰小、有效成分富集明显等优点，可以作为分离、纯化黄酮类化合物的一种有效方法。

3.3　提取溶剂和流动相的选择

笔者以毛蕊异黄酮的含量为指标来选择提取溶剂，采用超声法分别对甲醇、乙醇进行考察，结果表明甲醇的提取效率较高；笔者又分别考察了乙腈-水系统、甲醇-水系统，结果表明，液相条件为乙腈-水(含0.1%甲酸) 梯度洗脱，检测波长为260 nm时，系统基线稳定，分离效果良好，图谱各峰峰形较好，灵敏度高。

3.4　样品测定结果

目前对一年半内6批乌金胶囊中毛蕊异黄酮含量进行测定，结果发现不同批次间含量有一定的差异，可能与黄芪药材采收时间有关联，有必要进行长期的追踪考察，为进一步完善乌金胶囊的质量标准提供依据。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010:283-284.

[2]贺云彪，黄兰芳，胡伟，等.高效液相色谱测定黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量[J].光谱实验室，2010，27(4)：1541-1545.

[3]林青，李媛，谭晓梅，等.LC-MS/MS同时测定大鼠血浆中黄芪成分芒柄花素、毛蕊异黄酮和异鼠李素的浓度及其药动学研究[J].中药材，2013，36(4)：589-593.

[4]Chen J，Zhao XG，Ye Y，etal.Estrogen receptor beta-mediated proliferative inhibition and apoptosis in human breast cancer by calycosin and formononetin[J].Cell Physiol Biochem，2013，32(6)：1790-1797.

[5]Xu YH，Xiong JF，Wang SS，etal.Calycosin entered HUVECs and ameliorated AGEs-promoted cell apoptosis via the Bcl-2 pathway[J].J Nat Med，2014，68(1)：163-172.

[6]谢娟平.D101大孔树脂纯化犁头草黄酮的研究[J].陕西农业科学，2010，56(5):61-63.

[本文编辑]顾文华