响应面法优化真菌蛋白酶嫩化马肉的工艺

蒋小锋，任雯雯，达迪拉·买买提，张 文，孔令明

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

响应面法优化真菌蛋白酶嫩化马肉的工艺

蒋小锋，任雯雯，达迪拉·买买提，张 文，孔令明*

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

为了改善马肉（半腱肌）的嫩度，以蒸煮损失率、剪切力和感官评分为评价指标，结合滚揉处理，研究了真菌蛋白酶在不同的添加量、处理温度、处理时间和pH值对马肉嫩度的影响，并利用响应面优化出了真菌蛋白酶的最佳嫩化条件。结果表明：真菌蛋白酶的添加量对马肉的嫩度影响极显著，处理温度和处理时间影响显著；最佳的嫩化条件是：真菌蛋白酶添加量20.63U/g，处理温度53.12℃，处理时间98.88 m in，pH值为6.86。

马肉；真菌蛋白酶；嫩度

随着人们生活水平的提高，人们对肉的品质的要求也越来越高，不仅要求肉制品外观好看，口味鲜美，而且要富有营养。为了改善肉的加工特性和食用品质，通常在肉品加工过程中添加一些蛋白酶类[1]。真菌蛋白酶是来源于微生物的蛋白酶，如枯草芽孢杆菌蛋白酶、米曲霉蛋白酶等，具有较强的蛋白水解作用，最具有代表性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，它能在中性范围内将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸，广泛的应用于食品工业[2]，近几年来，由于欧洲国家盛行疯牛病、口蹄疫等疾病，马肉在欧美许多国家都大受欢迎，国内市场对马肉的需求量呈现逐年上升的趋势，各种马肉制品深受大家的喜爱[3]。马肉具有高蛋白、低胆固醇、高不饱和脂肪酸的特点[4]，但是，马肉肉质较为粗糙，口感不好，嫩度较差，需要对其采取一些措施改善其嫩度，提高其食用品质。SULLIVAN G A等[5]应用芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶对牛肉进行处理，发现所有的蛋白酶均可以增加肌原纤维和胶原蛋白的降解，显著提高了牛肉的食用品质，ASHIE I N A等[9]研究发现，来自米曲霉的天冬氨酸蛋白酶的最佳pH值为2.6～6.0，说明天冬氨酸蛋白酶不易受外界的环境的影响。YEH C M等[10]发现微生物蛋白酶和植物性蛋白酶相比，对肌原纤维蛋白质的降解能力低，但具有更强的水解胶原蛋白的能力。目前国内对马肉的研究较少，还未见使用真菌蛋白酶的报道和相关文献。

肉的食用品质特性中，色泽、持水力及其气味在蒸煮前后都可以进行测定，给消费者较为持久的感官印象，而多汁性、质地、嫩度、滋味和香味只能在咀嚼过程中获得，持续的时间较为短暂。其中，肉的嫩度反映了肉的质地，是消费者评价肉质优劣的常用指标[11]；一般评价肉食用品质的方法有客观评价法和感官评价法。感官评价简单易行，但误差大，可靠性差[12]；利用物性仪测量的剪切力值是客观反映肉嫩度的重要的方式[13]。本实验结合感官评价和物性仪两者的优点，以马肉（半腱肌）为原料，通过注射真菌蛋白酶液和滚揉处理，以蒸煮损失、剪切力和感官评定为评价指标，研究了真菌蛋白酶添加量、处理温度、处理时间和pH值对马肉嫩度的影响，并利用响应面试验方法优化了真菌蛋白酶嫩化马肉的最佳嫩化工艺，为改善马肉的食用品质提供了一些可靠的实验数据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

马肉：新疆昭苏县绿源食品有限责任公司；真菌蛋白酶（10万U/g）：澳大利亚Enzyme Solutions Pty.有限公司；干酪素（纯度99%）：上海酶联生物科技有限公司；三氯乙酸（分析纯）：上海迈瑞尔化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Testo-205便携式pH计：德图仪表（深圳）有限公司；NSE-11063数字显示温度计：美国Delta TRAK公司；DZKWS-6电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；TA-XT2i型物性仪：英国Stable Micro System公司；GL-16G-Ⅱ高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；Tu-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；GR-20真空滚揉机：诸城市美邦机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 真菌蛋白酶活力的确定[14]

采用紫外分光光度法测定，蛋白酶溶液1.0 m L与酪蛋白溶液5.0 m L混合，置（37±0.2）℃水浴中反应10 m in，加三氯乙酸溶液终止反应，用干燥滤纸过滤，滤液在2 h内采用分光光度法以水为空白，在波长275nm处测定吸光度值A；酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液顺序互换，其他操作相同，测定吸光度值A0；另取酪氨酸对照溶液，以0.1 mol/L盐酸溶液为空白，在波长275 nm处测定吸光度值An。

式中：W3为对照品溶液中含酪蛋白的量，μg/m L；W为供试样品的取样量，mg；11为测定总体积，m L；N为供试样品的稀释倍数。

蛋白酶活力定义：在一定温度和pH值条件下，每分钟水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需粗蛋白酶的量为1个酶活力单位（U）。

1.3.2 马肉嫩化处理的方法

将真菌蛋白酶溶于不同的pH值缓冲溶液中，使用一次性注射器将蛋白酶液注入肉中（注射量∶肉质量=1∶10，空白组注入等量的水），用自封袋包装好放置于滚揉机中滚揉30 min，取出放置于不同温度的恒温水浴锅中保温不同时间，最后取出待测，肉块的大小3 cm×3 cm×4 cm。

1.3.3 真菌蛋白酶最佳嫩化条件的确定

在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，采用Design-Expert 8.0.5软件中的Box-Behnken Design方法设计试验，对酶添加量、处理温度、处理时间、pH值4个因素进行探讨，以马肉剪切力（Y1）和感官评分（Y2）作为评价指标，确定真菌蛋白酶的最佳嫩化条件。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Fac tors and levels of response surface design

1.3.4 测定方法

（1）蒸煮损失的测定[15]：称取50 g左右的马肉切分成小块，放于蒸煮袋中，置于90℃水浴锅中加热。用数显式温度计测量肉的中心温度，当肉的中心温度达到75℃时，取出样品，冷却至常温，用滤纸擦干表面水分，然后称质量。蒸煮损失率按下式计算：

（2）剪切力：取适量大小的肉块置于蒸煮袋中，尽量将蒸煮袋中的空气排出，将袋口密封，在80℃恒温水浴锅中加热，当马肉中心温度达到70℃时，维持约30 m in，然后冷却至室温取样。沿着肌纤维方向切取1 cm厚、1 cm宽的肉条，然后在TA-XT2i型物性仪上测定其剪切力，重复测量5次并取其平均值。

剪切力测定参数：探头HDP/BSW；测试模式TPA；测试前速度2.00 mm/s；测试速度2.00 mm/s；测试后速度10.00 mm/s；下压距离30.00 mm；负载类型Auto-20g；数据获得率500数据包/s；样品规格5 cm×1 cm×1 cm。

其他物性测定参数同上。

（3）感官分析：将经过处理的马肉置于蒸煮锅中蒸制2 h，自然冷却至室温后切块品尝，20位品尝者在评定前进行专业细致的培训，品尝实验在独立的安静隔间内进行，对嫩度、咀嚼性、风味、颜色四项分别打分，满分为100分，取20位品尝者平均分为马肉感官评分，评价标准见表2。

表2 马肉感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standard o f horse meat

1.3.5 数据分析

实验数据由Design-Expert 8.0.5进行分析，剪切力采用Stable M icro System所带的Exponent处理分析，其他数据采用Excel软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同真菌蛋白酶添加量对马肉嫩度的影响

在真菌蛋白酶添加量分别为0、5 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g和30 U/g，处理温度为55℃，处理时间为80 m in，pH值为6.0的条件下分别测量马肉的蒸煮损失率、剪切力和感官评价3个评价指标，结果如图1所示。

图1 真菌蛋白酶添加量对马肉蒸煮损失率(a)、剪切力和感官评分(b)的影响Fig.1 Effects of different fungal protease addition on cooking loss(a) and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由图1a可知，与未处理组相比，随着真菌蛋白酶添加量的逐渐增加，蒸煮损失率呈现先减小后增加的趋势；当真菌蛋白酶的添加量达到20 U/g时，蒸煮损失率减小最为明显，随着添加量的为进一步增大，马肉的蒸煮损失率明显增大；原因是低浓度的蛋白酶可以提高肉的持水能力，增加肉的保水性和多汁性；如果蛋白酶液添加量过大，就会导致水解过度，肉的保水性能会发生显著下降。由图1b可知，马肉的剪切力和真菌蛋白酶添加量呈现显著地相关性，随着真菌蛋白酶添加量的不断增加，马肉的剪切力值呈现显著下降的趋势；当真菌蛋白酶的添加量为15 U/g时，马肉的剪切力值为4.613 kg，已经达到了中等嫩度的水平，此时的马肉软硬适中，易于咀嚼，又不失嚼劲，鲜嫩可口，从感官评价中也可以看出，此时的感官评分为84分，说明此时马肉的嫩度已经很受消费者喜爱，当量增加至20 U/g时，剪切力进一步减小，此时的感官评分最高；当进一步提高真菌蛋白酶的添加量，马肉的剪切力虽然更小，但此时的感官评分开始显著下降；原因是由于蛋白酶添加量过大，水解蛋白过度，使肌原蛋白和肌原纤维蛋白过度水解，导致马肉的外观和质地很大破坏，同时肉的保水性能也显著下降，失去了马肉具有的嚼劲和多汁性，嫩化效果不好。因此，真菌蛋白酶液的添加量为20 U/g最为合适。

2.2 不同处理温度对马肉嫩度的影响

在处理温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，真菌蛋白酶添加量20 U/g，处理时间80 m in，pH值为6.0的条件下分别测定马肉的蒸煮损失率、剪切力和感官评价3个评价指标，结果如图2所示。

图2 处理温度对马肉蒸煮损失率(a)、剪切力和感官评分(b)的影响Fig.2 Effects of treatment temperature on cooking loss(a)and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由图2a可知，真菌蛋白酶液的处理温度对蒸煮损失率的影响也很大，随着处理温度的升高，蒸煮损失率会逐渐减小，当处理温度为55℃时，此时的蒸煮损失率是最小的；当进一步提高处理温度，蒸煮损失率会变大；原因是真菌蛋白酶的活性受温度影响很大，当真菌蛋白酶所处环境的温度在其最适范围内时，真菌蛋白酶的活性最大，水解能力最强，反之真菌蛋白酶的活性就会下降，水解能力减弱。由图2b可以看出，随着处理温度的升高，剪切力值下降明显，在55℃时达到最小值；当温度继续升高，剪切力值发生明显升高；原因是此时的处理温度过高，导致蛋白酶部分失活，水解蛋白能力下降；由感官评分可以看出，剪切力值过高或过低，都会影响消费者的感官评价，当处理温度为55℃时，感官评分较高，因此处理温度在55℃是较为合适的处理温度。

2.3 不同处理时间对马肉嫩度的影响

在处理时间分别为20 m in、40 m in、60 m in、80 m in、100 min、120 min，真菌蛋白酶添加量为20 U/g，处理温度55℃，pH值为6.0的条件下，分别测定马肉的蒸煮损失率、剪切力和感官评价3个评价指标，结果如图3所示。

图3 处理时间对马肉蒸煮损失率(a)、剪切力和感官评分(b)的影响Fig.3 Effects of different treatment time on cooking loss(a)and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由图3a可知，使用真菌蛋白酶处理马肉的时间对蒸煮损失率的影响也很大，因为处理时间直接影响着真菌蛋白酶水解蛋白的时间；随着处理时间的增大，马肉的蒸煮损失率逐渐减小，当处理时间为100 min时，此时的蒸煮损失率达到了最小值，为28.7%；当进一步增加处理时间，蒸煮损失率则会增加，原因是蛋白酶的水解作用时间越长，水解蛋白质就越充分，当处理时间过长时，就会出现水解过度的现象，此时不仅不会增加肉的保水性能，相反还会导致不必要的水分流失，影响肉的多汁性。由图3b可以看出，处理时间和剪切力呈现显著地负相关性，处理时间越长，剪切力值越小，当作用时间为100 m in左右时，此时的剪切力值适中，感官评分也最高，当进一步增加处理时间，感官评分有所下降，由于蛋白酶作用时间过长，嫩化效果不佳。因此综合各个因素，选择处理时间100min为宜。

2.4 不同pH值对马肉嫩度的影响

在pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，真菌蛋白酶添加量为15 U/g，处理温度55℃，处理时间为80 min的条件下分别测定马肉的蒸煮损失率、剪切力和感官评价3个评价指标，结果如图4所示。

图4 处理时间对马肉蒸煮损失率(a)、剪切力和感官评分(b)的影响Fig.4 Effects of different pH value on cooking loss(a)and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由图4a可知，不同pH值的真菌蛋白酶液对马肉的蒸煮损失率影响不显著，基本都在32.5%左右，但在偏酸性的环境中真菌蛋白酶的活性也会受到影响。由图4b可以看出，pH值对剪切力值得影响也不明显，在pH值为7.0时的剪切力是4.548 kg，但剪切力的总体变化不明显，说明真菌蛋白酶的pH值使用范围较大，不容易受到外界酸碱性的影响；由于剪切力值得范围变化不大，感官评分变化也不大，说明在这个范围内，消费者对马肉嫩度的可接受性比较相似。因此，真菌蛋白酶在pH值在6.0左右是最佳的。

2.5 真菌蛋白酶最佳嫩化条件的筛选

在单因素试验的基础上，以真菌蛋白酶添加量、处理温度、处理时间和pH值为自变量，分别以剪切力（Y1）和感官评分（Y 2）为响应值，进行响应面优化试验。由于剪切力和感官评价可以更为直观准确地对马肉的食用品质进行评价，所以响应面试验中未将蒸煮损失率作为评价马肉食用品质的最终指标。响应面试验设计及结果如表3所示，方差分析结果见表4。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface methodology

表4 真菌蛋白酶嫩化马肉工艺优化数学模型方差分析Table 4 Mathematical model variance analysis for fungal protease tenderization conditions optimization

由表4可知，以剪切力（Y1）为响应值的二次方程具有极显著性（P＜0.01），一次项中蛋白酶添加量、处理温度和处理时间极显著，pH值影响不显著，这和单因素的试验结果也是一致的；各个因素的交互作用不显著，二次项中真菌蛋白酶添加量和处理温度影响显著，说明真菌蛋白酶的添加量和处理温度对剪切力的影响极显著，处理时间显著，各因素对剪切力值的影响大小因素为真菌蛋白酶添加量＞处理温度＞处理时间＞pH值。以感官评分（Y2）为响应值的二次方程也具有极显著性（P＜0.01），一次项中真菌蛋白酶添加量和处理时间影响显著；真菌蛋白酶和处理温度的交互作用影响极显著，处理温度和处理时间的交互作用影响显著；二次项中真菌蛋白酶的影响极显著，各因素对感官评分的影响大小因素为处理时间＞真菌蛋白酶添加量＞pH值＞处理温度。

采用响应面方法分析试验结果，得到以剪切力及感官评分为响应值的回归方程：

根据响应面分析建立的数学模型，得到的最佳工艺条件是：真菌蛋白酶添加20.63 U/g，处理温度53.12℃，处理时间98.88 min，pH值为6.86。在此条件下剪切力的预测值为4.1 kg，感官评分为86.53分。

2.6 验证试验

通过响应面分析，得出真菌蛋白酶嫩化马肉（半腱肌）的最佳工艺参数是：真菌蛋白酶添加量20.63 U/g，处理温度53.12℃，处理时间98.88 min，pH值为6.86。在此条件下剪切力的预测值为4.1 kg，感官评分为86.53分。在给出的模型中，按实际操作确定的是真菌蛋白酶添加量20 U/g，处理温度为55℃，处理时间为100 m in，pH值为7.0的条件下马肉进行处理，在此条件下做5组平行试验，检验模型的准确性；得出的剪切力值为4.3 kg，感官评分为82分，试验验证值接近模型的预测值，证明模型可以较好的预测真菌蛋白酶嫩化马肉（半腱肌）的嫩化工艺。

2.7 嫩化效果对比

利用TA-XT2i型物性仪对空白组和处理组的各项物性进行检测，检测结果见表5。

表5 真菌蛋白酶嫩化马肉最优条件对其物性的影响Table 5 Physical characteristics of horse meat with fungal protease under the optimum condition

由表5可知，马肉（半腱肌）经过真菌蛋白酶嫩化处理后，剪切力值明显下降，几乎减少了一半，肉质明显变软，由于蛋白酶的水解作用，肉质的胶着性和咀嚼性弱化，但也在可接受的范围内，肉质的弹性也有所减弱，但变化不明显。总之，经过真菌蛋白酶嫩化后的马肉肉质鲜嫩，保水性好，具有很好的口感。

3 结论

通过响应面试验结果可知，真菌蛋白酶的添加量对剪切力值的影响最为显著，处理温度次之，然后是处理时间，最后是pH值；通过响应面试验得出的真菌蛋白酶嫩化马肉的最佳条件是真菌蛋白酶添加量20.63 U/g，处理温度53.12℃，处理时间98.88 min，pH值为6.86。在此条件下处理的马肉软硬适中，多汁性好，嫩化效果很好，显著提高了马肉的食用品质。

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Optimization of fungal protease treatment for horsemeat tenderization by response surface methodology

JIANG Xiaofeng,REN Wenwen,DADILA·Maimaiti,ZHANG Wen,KONG Lingming*
(College of Food and Pharmaceutics,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

To improve the tenderness of horsemeat(semitendinosus),using cooking loss rate,shear force and sensory evaluation as the evaluation index,combining with rolling treatment,the effects of different fungal protease addition,treatment time,temperature and pH on horse meat tenderness were studied,and then the optimal meat tenderization conditions were optimized by response surface methodology.The results showed that fungal protease had highly significant effects on horsemeat tenderness,and the treatment temperature and time had significant effects.The results showed that the optimal condition was fungal protease addition 20.63 U/g,treatment temperature 53.12℃,time 98.88 min,and pH 6.86.

horse meat;fungal protease;tenderness

TS251

A

0254-5071（2015）03-0038-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.009

2015-01-21

“十二五”国家科技支撑计划课题（2014BAD04B11）

蒋小锋（1989-），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏。

*通讯作者：孔令明（1976-），男，副教授，硕士，研究方向为农产品加工及综合。