利用葡萄渣黑曲霉固态发酵产果胶酶的研究

曹珂珂，李 妍

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

利用葡萄渣黑曲霉固态发酵产果胶酶的研究

曹珂珂，李 妍

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

对黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6利用葡萄渣固态发酵产果胶酶的发酵条件进行研究。结果表明，在基础发酵培养基中添加葡萄糖4%、硫酸铵0.6%，含水量60%，培养温度30℃条件下培养72 h，果胶酶酶活达12.226 U/g。

果胶酶；葡萄渣；黑曲霉；固态发酵

Key worlds:pectinase;grape pomace;Aspergillus niger;solid state fermentation

果胶酶（pectinase）是分解果胶物质的多种酶的总称，主要包括原果胶酶（protopectinase，PPase）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果胶裂解酶（pectate lyases，PL）和果胶酯酶（pectin esterase，PE）[1-3]。果胶酶是世界上四大酶制剂之一，主要应用于果汁澄清、果蔬汁提取、果实脱皮、木材防腐、麻类脱胶、棉织物精炼加工等行业[4-6]。果胶酶来源于植物和微生物，目前商品果胶酶主要来源于微生物所产的果胶酶。细菌、放线菌、霉菌和酵母菌都能产生果胶酶[7-9]，黑曲霉（Aspergillus niger）是公认的安全级微生物，其代谢产物果胶酶也是安全的。

葡萄渣是酿酒过程中的下脚料，包括葡萄籽和葡萄皮，其含有粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、多种微量元素和果胶等[10-11]。葡萄渣一般都是直接作为饲料，其所产生的经济价值相对较低，通过固态发酵能提升葡萄渣的潜在价值。目前利用葡萄渣固态发酵产果胶酶的研究还比较少，因此本实验采用黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6作为产酶菌株，利用葡萄渣和麸皮固态发酵生产果胶酶，为提高葡萄渣的产品附加值开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉（A.niger）BB-6由蚌埠学院生物与食品工程系微生物实验室保存；葡萄渣为鲜葡萄榨汁后，果渣烘干、粉碎、过筛。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯浸汁（20%）100 m L，葡萄糖2 g，琼脂1.5～2 g，pH自然。

初始发酵培养基：麸皮10 g，水60%，pH自然。

半乳糖醛酸（分析纯）：上海酶联生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）试剂、葡萄糖、硫酸铵等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；果胶：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；BHC生物洁净安全柜：苏州净化设备有限公司；LRH微电脑控制生化培养箱：广东省医疗器械厂；KDC高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；BSD立式智能精密摇床：上海恒讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 果胶酶活力检测

采用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）[12]。酶活定义：在50℃、pH 5.0的条件下，1 h分解果胶产生1 mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U/g）。

1.3.2 葡萄渣与麸皮的添加比例

在初始发酵培养基中添加葡萄渣，使葡萄渣与麸皮分别按不同质量比0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0混合均匀。灭菌后接入1 m L孢子悬液（含黑曲霉孢子107CFU/m L），30℃培养72 h，每隔24 h扣瓶一次，确定葡萄渣与麸皮的最佳比例。固态发酵结束后，在三角瓶中加入料液比1∶10（g∶m L）的含0.01%吐温-80的蒸馏水，在30℃条件下浸提50 min。抽滤，4 000 r/m in离心15 m in，上清即为粗酶液，测定果胶酶酶活。

1.3.3 培养基和培养条件优化的单因素试验

（1）有机碳源：在固态基础发酵培养基中分别加入葡萄糖2%、4%、6%、8%、10%，考察葡萄糖的添加量对果胶酶酶活的影响。

（2）无机氮源：在固态基础发酵培养基中分别加入硫酸铵0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，考察硫酸铵的添加量对酶活的影响。

（3）培养温度：将固态基础发酵培养基分别在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃培养72 h，考察温度对酶活的影响。

（4）培养时间：将固态基础发酵培养基在一定温度下将黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6分别培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，考察培养时间对酶活的影响。

（5）含水量：将固态基础发酵培养基含水量分别调为30%、40%、50%、60%、70%，考察含水量对酶活的影响。

1.3.4 培养条件优化正交试验

在单因素试验的基础上，选取碳源、无机氮源、培养温度和含水量4个因素进行正交试验。

2 结果与分析

2.1 葡萄渣与麸皮的添加比例

表1 葡萄渣和麸皮的不同配比对产酶的影响Table 1 Effect of different ratio of grape promace and wheat bran on pectinase production

相对于初始发酵培养基（10 g麸皮），添加葡萄渣有利于果胶酶的产生，因为葡萄渣中含有果胶物质，而果胶酶属于诱导酶，葡萄渣既是诱导物又可以作为碳源，所以添加葡萄渣能提高果胶酶的产量。葡萄渣和麸皮的比例合适，不仅对产酶有利，而且还能减少原料的浪费。由表1可知，当葡萄渣与麸皮以5∶5质量比混合时酶活最大7.122 U/g。麸皮含有多种营养物质，可以提供碳源、氮源，而且有一定的疏松度，能给黑曲霉的生长提供充足的氧气。葡萄渣作为诱导物添加到培养基中，随着葡萄渣含量的增加，果胶酶活力逐渐增提高，若继续增加其含量，则酶活随之下降，可能是葡萄渣含量过高，吸水后容易结块，影响氧的传递进而影响黑曲霉生长。因此，葡萄渣与麸皮以质量比5∶5作为固态基础发酵培养基为宜。

2.2 培养基和培养条件优化的单因素试验结果

2.2.1 有机碳源对产酶的影响

图1 葡萄糖添加量对酶活的影响Fig.1 Effect of glucose addition on pectinase activity

由图1可知，在基础培养基中添加有机碳源葡萄糖对酶活力有一定的影响，酶活力随着葡萄糖添加量的增加先升高后降低。一定含量的葡萄糖能提高果胶酶的产量，

而过多的葡萄糖则抑制了酶的产生。当葡萄糖的含量为4%时，酶活力达到最大8.496 U/g。

2.2.2 无机氮源对产酶的影响

图2 硫酸铵添加量对酶活的影响Fig.2 Effect of ammonium sulfate addition on pectinase activity

硫酸铵是速效无机氮源，在发酵初期首先被利用，价格低廉，适合于工业生产。在固态基础发酵培养基中添加硫酸铵对酶活有一定的影响。由图2可知，随着硫酸铵添加量的增加，酶活先升高后降低，当硫酸铵的添加量为0.4%时，酶活力最大为8.709 U/g。

2.2.3 培养温度对酶活的影响

将固态基础发酵培养基分别放入20～35℃培养72 h，考察培养温度对酶活的影响，结果见图3。

由图3可知，培养温度对酶活力的有一定的影响，适宜的温度有利于菌体的生长和果胶酶的产生，其最佳产酶温度为28℃，发酵时可以控制培养温度在28～30℃。

图3 培养温度对酶活的影响Fig.3 Effect of culture temperature on pectinase activity

2.2.4 含水量对酶活的影响

水是机体的重要组成部分，培养基的含水量影响菌体细胞的生长繁殖，同时也是产酶的重要影响因素之一。在固态基础发酵培养基中加入30%～70%的水，考察含水量对酶活的影响，结果见图4。

图4 含水量对酶活的影响Fig.4 Effect of water content on pectinase activity

由图4可知，培养基含水量为30%～50%，果胶酶酶活力随着含水量增加而增高；培养基含水量＞50%后，果胶酶酶活力随着含水量增加而降低；其含水量为50%时，果胶酶活力最大8.343 U/g。培养基含水量低，无法满足菌体生长所需的水分，产酶较少；培养基含水量过高，培养基容易结块，影响氧的传递，黑曲霉只能在培养基的表面生长，发酵不均匀而影响产酶。因此，培养基含水量50%为宜。

2.2.5 培养时间对酶活的影响

培养时间对产酶非常重要，如果培养时间短，菌体处于生长期，产酶量很少；如果培养时间过长，培养基消耗过多，营养物质供应不上，产酶减少，同时菌体在生长代谢中还会产生很多副产物，影响产酶及后期酶的纯化。由图5可知，随着培养时间的增加，酶活逐渐增强，72 h时酶活达到最大7.961 U/g，此后继续培养，果胶酶活力虽有所下降，但降幅相对较小。因此，培养时间为72 h为宜。

图5 培养时间对酶活的影响Fig.5 Effect of culture time on pectinase activity

2.3 培养条件优化正交试验

在单因子试验的基础上，固定培养时间为72 h，以果胶酶活力作为评价指标，通过正交试验对菌株产酶条件（葡萄糖添加量、硫酸铵添加量、培养温度、含水量）进行优化，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 培养条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for culture conditions optimization

由表2可知，4种因素对产酶的影响大小依次为葡萄糖添加量＞含水量＞硫酸铵添加量＞培养温度，最佳培养基组合是A2B3C4D3，即葡萄糖添加量4%，硫酸铵添加量0.6%，培养温度30℃、含水量60%。在此最佳条件下进行验证试验，测得果胶酶活力为12.226 U/g。由表3可知，葡萄糖的添加量对果胶酶活性有显著的影响，其他因素对果胶酶活性影响均不显著。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

3 结论

葡萄渣作为酿酒行业的副产物，大多被作为饲料或肥料，甚至作为垃圾直接扔掉，不仅附加值低，还可能会造成环境污染[13-15]。为了扩大葡萄渣的应用范围，本研究采用黑曲霉BB-6作为产酶菌株，利用葡萄渣固态发酵产果胶酶，对其产酶培养基和培养条件进行优化。结果表明，在麸皮5 g、葡萄渣5 g的基础发酵培养基中添加4%葡萄糖和0.6%硫酸铵，含水量60%，30℃恒温培养72 h，果胶酶酶活达12.226 U/g，说明利用葡萄渣固态发酵产果胶酶是可行的，通过此方法能提高葡萄渣的应用价值。

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《中国酿造》杂志社

Pectinase production by Aspergillus niger solid state fermentation with grape pomace

CAO Keke,LI Yan
(Department of Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233030,China)

The fermentation conditions of Aspergillus niger BB-6 by solid-state fermentation with grape pomace for pectinase production were studied.The results showed that the optimal culture condition for the basic fermentation culture medium was glucose 4%,ammonium sulfate 0.6%, water content 60%.Under the condition of 30℃,the activity of pectinase could reach 12.226 U/g at 72 h.

Q939.97

A

0254-5071（2015）03-0083-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.019

2015-01-19

蚌埠学院自然科学研究项目（2011ZR16）；蚌埠学院优秀中青年骨干教师培养计划

曹珂珂（1980-），女，讲师，硕士，研究方向为微生物发酵。