低温冷冻及分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定植物油中104 种农药残留

徐 娟， 王 岚， 黄华军 ， 陈 捷， 陈文锐， 相大鹏

（广东出入境检验检疫局，广东 广州510623）

随着农业科学技术和经济水平的提高，农产品已基本满足数量安全的要求，人们越来越关注农产品与食品的质量安全情况。我国是世界第一植物油消费大国，但我国对于植物油中农药残留的研究与国际水平仍存在一定差距［1］。

如何有效去除油脂，减少对仪器的损伤是建立植物油中多农药残留检测方法的关键［2］。传统的油脂检测方法中，多采用液液萃取（LLE）以及近年来兴起的加速溶剂萃取（ASE）和凝胶色谱技术（GPC），但这些前处理方法的过程较为繁琐，且对于多种目标化合物难以兼顾，与目前实验室检测工作所追求的高通量快速检测有一定距离［3，4］。

另外，传统检测方法中多使用气相色谱（GC）和气相色谱-质谱（GC-MS）。某些极性较强的除草剂和有机磷类的农药在GC-MS 上的灵敏度比较差，导致方法检测限偏高［5-9］。近年来液相色谱与质谱技术联用的迅猛发展，液相色谱-串联质谱（LC-MS／MS）凭借其分离能力高、适用范围极广及灵敏度高、选择性好的特点，已成为农药多残留分析中应用最广泛的联用技术［10-16］。

本研究以104 种常用农药为分析对象，采用分散固相萃取（D-SPE）技术作为前处理手段，与超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）联用，建立了橄榄油、棕榈油和花生油这3 种常用植物油中多种农药残留的高通量检测方法，并用于植物油脂的品质监控。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

API 4000 串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配Shimadzu LC 20 液相色谱仪（四元低压梯度输液泵、自动进样器、柱温箱）、电喷雾离子（ESI）源和Analyst 1.5.1 仪器控制及数据处理软件（美国应用生物系统公司）。

乙腈、甲醇为色谱纯（TEDIA，USA），无水硫酸镁、氯 化 钠、C18 粉 末、PSA （primary secondary amine）粉、二水合柠檬酸钠、倍半水合柠檬酸二钠均为分析纯（Sigma-Aldrich，USA），乙酸铵为质谱级（Fluka Chemie AG，Germany）。实验用水均为超纯水（Millipore，USA）。标准物质均购自Dr. Ehrenstorfer 公司（10.0 mg／L，纯度≥96.0%）。

1.2 样品处理

准确称取5.00 g 植物油样品，加入5 mL 正己烷、5 mL 超纯水、5 mL 乙腈和2 g 氯化钠，振荡10 min，以4 000 r／min 离心5 min，移去上层清液，下层重复提取一次。合并提取液，冷冻2 h，取1.0 mL上清液与150 mg 无水硫酸镁、50 mg PSA 和50 mg C18 粉末混合，以12 000 r／min 离心5 min，取0.5 mL 上清液与0.5 mL 超纯水混合，过0.2 μm 滤膜，装瓶待测。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱：Restek C18（100 mm×2.1 mm，3 μm，USA）；柱温：35 ℃；平衡时间：5 min；进样量：10 μL；流速：0.5 mL／min；流动相：采用10 mmol／L乙酸铵水溶液（A）和10 mmol／L 乙酸铵甲醇溶液（B）组成的流动相进行梯度洗脱。洗脱条件：0 ～8 min，20.0% B ～90.0% B；8 ～12 min，90.0% B ～100.0%B；12 ～14.8 min，100.0% B；14.8 ～14.9 min，100.0%B ～20.0%B；15 min，停止。

电喷雾离子源正离子扫描（ESI＋）；检测方式：编程的多反应监测（scheduled-MRM）模式；气帘气：15 L／min；雾化气（GS1）：60 L／min；辅助加热气（GS2）：70 L／min；碰撞活化解离（collision-activated dissociation，CAD）碰撞气：中等（medium）；辅助加热气温度：500 ℃；喷雾电压：5 000 V。目标物的相关信息见表1。

表1 各目标化合物的质谱参数Table 1 MS parameters for the target analytes

表1 （续）Table 1 （Continued）

表1 （续）Table 1 （Continued）

1.4 标准溶液的配制

实验所用标准溶液为10.0 mg／L 商品化混合标准溶液（104 种农药共分为4 组），使用前保存于-18 ℃下，工作曲线溶液（0、1、2、5、10、20 和30 μg／L）使用前用相应空白基质提取液配制。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

本实验检测的104 种目标化合物的性质差异较大，对比研究了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、乙酸铵甲醇溶液-乙酸铵水溶液作为流动相的结果。发现在甲醇-水体系下的响应优于乙腈-水体系。而流动相中加入适量的乙酸铵可以使待测物在测试时成为离子状态，然后在电喷雾过程中将离子从溶液中转移至气相中，使气相离子的生成过程更容易完成，从而提高待测物的离子化效率；同时还可以抑制待测物与色谱柱固定相中残留硅羟基之间的“二次作用”，达到改善峰形、提高分离效果的作用；而且有机相与水相中盐浓度相等，也保证了梯度变化过程中盐的浓度和离子化氛围酸性稳定。因此，最终本实验采用10 mmol／L 乙酸铵甲醇溶液-10 mmol／L 乙酸铵水溶液作为流动相体系。

本实验采用Restek C18 色谱柱，填料粒径为3 μm，与常规液相色谱柱相比具有更高的灵敏度和分离能力，且分离时间较常规液相色谱柱大大缩短。通过优化色谱分离条件，使目标化合物与抑制电离的基质实现最大程度的有效分离，可以降低基质对质谱检测的影响。空白基质中104 种化合物的MRM 色谱图如图1 所示。

图1 空白基质中104 种化合物的MRM 色谱图（0.01 mg／kg）Fig.1 MRM chromatograms of the matrix-matched standards of the 104 analytes （0.01 mg／kg）

2.1.2 质谱条件的优化

本研究尝试使用大气压化学电离（APCI）源和ESI＋源。发现使用APCI 源时噪声基线低，但目标物的响应值也偏低；ESI＋条件下响应较好，满足灵敏度要求。用蠕动泵以10 μL／min 的流速连续注射，分别将0.5 mg／L 的每组农药标准溶液注入ESI 源中，在正离子检测方式下进行一级质谱分析（Q1 扫描），得到准分子离子峰［M＋H］＋，优化去簇电压。对准分子离子峰进行二级质谱分析（子离子扫描），得到二级质谱碎片的全谱信息，优化碰撞能，同时建立标准物质二级碎片谱库，以便谱库检索能够实现对化合物同时定性定量的目的。此外，还对离子源温度、雾化气、气帘气、辅助气等参数进行了优化，优化的条件见1.3 节。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取试剂的优化

在进行提取试剂的优化实验时选择了6 种提取方案，分别是（A）5 g 油与5 mL 正己烷混合，以5 mL 乙腈提取，共提取两次，合并提取液；（B）5 g 油与5 mL 正己烷及5 mL 水混合，以5 mL 乙腈提取，共提取两次，合并提取液；（C）5 g 油与5 mL 乙腈饱和的正己烷以及5 mL 水混合，以5 mL 乙腈提取，共提取两次，合并提取液；（D）5 g 油与5 mL 水混合，加入1 g 氯化钠，以5 mL 乙腈提取，共提取两次，合并提取液；（E）5 g 油，以5 mL 乙腈提取，共提取两次，合并提取液；（F）5 g 油，以10 mL 乙腈提取一次。以0.05 mg／kg 的104 种目标化合物为样品，采用了两种方式比较提取试剂的优劣：其一为比较回收率（见图2），其二为称量共提取物（见图3）。两种方式的结果都充分说明提取方式B 为最优化方案。

对上述优化结果进行了分析。首先，乙腈的通用性强，对农药的溶解度较大，可溶入的杂质量适中，是目前针对多残留提取较为普遍的选择。其次，由于植物油中含水量极低，并且具有一定的黏性，单纯使用乙腈在提取时可能存在分散不够完全的现象，加入少量的水，提高了乙腈对于样品的渗透性，可以将基体分散得非常均匀。再次，除油脂外，正己烷中可溶入的杂质量比较少，特别是正己烷与水进行两相分配时，大部分杂质在水相中；对于植物油样品来说，由于其与乙腈互溶性不佳，直接提取效率不高，所以先使用正己烷溶解，再用乙腈萃取，这样既可以提高对目标物的提取效率，又可以减少植物油中最主要的干扰杂质油脂的溶入量，对后续进行的净化步骤有利。故本方法最终先采用正己烷-水溶解分散基质，再加入乙腈溶液提取，最后加盐至盐析分层。操作简单，净化效果显著，提取效率高。

2.2.2 冷冻时间的优化

在进行了提取步骤以后，虽然大部分的油脂保留在残渣内，但仍有少部分进入了乙腈层。为了进一步净化，采用了冷冻的方式去除油脂。将不同提取方式得到的乙腈提取层同时放入-18 ℃冰箱内冷冻，间隔一段时间后取出2 mL 提取液，吹干后称重，利用差减法绘制出冷冻效果曲线（见图3）。随着冷冻时间的延长，提取液中的油脂含量显著下降，但当冷冻时间达到2 h 以后，该趋势趋于平稳。因此认为冷冻2 h 较合适。

2.2.3 D-SPE 条件的优化

在进行D-SPE 条件优化时，选择了3 种净化方案：50 mg MgSO4和50 mg PSA；150 mg MgSO4、50 mg PSA 和50 mg C18；150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18 和10 mg GCB。以0.05 mg／kg 的104种目标化合物为样品，先在上文优化的条件下进行LLE，提取液用于分散固相萃取净化条件的优化（见图4）。

图2 提取方法的优化Fig.2 Optimization of extraction methods

提取液经液液分配除去部分杂质后，再使用C18 和PSA 粉末分别吸附非极性和极性杂质，净化效果良好。C18 材料的硅胶上接有十八烷基，为其有效成分，有较高的相覆盖率和碳含量，对非极性物质有较高的容量，特别对油脂的去除有十分显著的效果，同时还可以去除其他一些非极性的杂质。PSA材料的硅胶表面键合有极性官能团（氨基），为其有效成分，能从样品中吸附极性化合物，再应用比样品本身极性更强的溶剂来洗脱分析物。PSA 对样品中的一些强极性杂质、有机酸、色素和金属离子（通过配合作用）等具有良好的净化效果。无水MgSO4用于除去盐析分配后乙腈层中含有的少量水分，以免PSA 粉末吸水导致性能下降。虽然加入少量GCB 粉末可以去除部分色素，但对于一些平面结构的化合物可能产生吸附作用而导致回收率下降。综合考虑，选择MgSO4、PSA 和C18 进行DSPE。

2.3 基质效应

近几年，与液相色谱-电喷雾电离-质谱法有关的基质效应（matrix effect，ME）问题逐渐引起分析工作者的关注［17］。在常规液相色谱-质谱法的方法确证过程中，一般采用同一来源的空白样品配制系列标准样品和质控（QC）样品，以抵消基质效应对方法的精密度和结果的准确度产生的影响。但在方法的实际应用中，因所测定的样品具有不同的来源或大批量测定时所涉及的样品基质复杂多样，无法严格地保证配制定量工作曲线溶液所使用的空白基质与检测样品一一对应。因此，通常选择对样品进行稀释、延长目标化合物的保留时间（尽量大于3 min）以及选择性质相近的基质制备的曲线进行定量的方法来减小基质效应带来的误差。

在本研究中，涉及的植物油种类有棕榈油、花生油和橄榄油。但是大批量的实际检测时涉及的品种繁多，因而只能选择近似的基质配制标准曲线来进行定量。但为了保证结果的准确性，选择了简略的标准曲线法对基质效应进行了考察。分别采用流动相、空白棕榈油提取液、空白花生油提取液和空白橄榄油提取液配制3 组工作曲线溶液，每组标准曲线中含有相同的15种以上的化合物，以不同基质中的同种化合物的响应值对相应含量绘制标准曲线（以图5 为例）。通过对标准曲线斜率的比较发现，不同基质对于不同化合物的确存在基质效应，且绝大多数表现为抑制效应。但是，不同基质间的基质效应并无显著性差异。因此通过标准曲线实验结果证明，在无法找到完全一致的空白样品基质配制标准曲线时，采用相近空白基质配制标准曲线所测定的结果准确可靠。

图3 冷冻时间的优化Fig.3 Optimization of frozen time

2.4 线性范围和定量限

在方法所确定的实验条件下，用乙腈／水溶液（6 ∶4，v／v）稀释各化合物的标准溶液，配成一系列质量浓度（0、1、2、5、10、20 和30 μg／L）的溶液，以仪器响应峰面积对各目标化合物的质量浓度进行线性回归。结果表明，80% 的化合物线性方程的相关系数均大于0.996，定量限（LOQ，S／N≥10）可达1 μg／kg。实际样品测定时，如某化合物有检出，应当采用相应的空白基质匹配外标法对其进行定量。如含量超过线性范围，可适当加大样品的稀释倍数，并依据欧盟SANCO／12571／2013 进行定性和定量。

2.5 方法的回收率和精密度

图4 D-SPE 条件的优化（0.05 mg／kg）Fig.4 Optimization of D-SPE （0.05 mg／kg）

图5 不同植物油的基质效应Fig.5 Matrix effects of different vegetable oils

本实验依据欧盟SANCO／12571／2013 进行方法验证。选择3 种基质（花生油、橄榄油和棕榈油）分别添加10.0、20.0、50.0 μg／kg 进行回收率和精密度试验，每个水平重复6 次。平均回收率为55%～121%，RSD 为0.47% ～19.2%，能够满足多种农药残留同时分析的要求。

应用本方法在100 份进口植物油脂中检出3 份样品中含有倍硫磷，日常工作表明该方法稳定有效。

3 结论

本方法可应用于日常检测工作，对保护消费者的食品安全起到一定作用，并可通过监控数据，对生产基地进行用药指导，有效避免了可能发生的贸易摩擦和损失。

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