新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料的合成及其在蛋白质N-糖链富集中的应用

白海红， 范 超， 沈丙权， 田 芳， 邓玉林，潘一廷 ， 秦伟捷* ， 钱小红

（1. 北京理工大学生命学院，北京100081；2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京102206；3. 北京石油化工学院化学工程学院，北京102617）

N-糖基化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与了几乎所有重要的生理过程，例如受精、发育、免疫应答、细胞间识别及通讯等［1，2］。蛋白质N-糖链的组成和结构对糖基化蛋白质的构象、功能以及与其他生物分子的相互作用都具有巨大的影响。大量研究表明，多种疾病的发生发展过程中都伴随着蛋白质N-糖链组成和结构的改变，如肿瘤、自身免疫疾病、糖尿病等［3，4］。因此，发展高通量、高灵敏度的蛋白质N-糖链鉴定技术对于阐明糖链在各个生理过程和疾病发生发展过程中的作用以及筛选临床诊断标志物尤为重要。但是N-糖链本身含量有限，并具有高度微不均一性，同时质谱分析信号易受高丰度蛋白质、肽段、核酸及盐类等的干扰［5］，因此，对N-糖链进行高效、高选择性的富集是实现其高灵敏度鉴定的必要前提。

目前常用的N-糖链富集方法主要有凝集素法［6，7］、硼酸富集法［8，9］及亲水相互作用色谱法［10，11］等。其中，亲水相互作用色谱法利用较强亲水性的N-糖链可以与氨基、酰胺基、羟基等亲水基团形成氢键、偶极作用和静电相互作用的特性，使用键合了亲水基团的色谱填料有效保留糖链，达到特异性富集并与蛋白质和多肽分离的目的。常用的亲水填料一般是在硅胶填料表面键合单层两性离子、乙二醇结构或酰胺等基团，但其亲水性有限，对于复杂样品中低丰度N-糖链的分离富集选择性不高［12，13］。我们利用表面引发-原子转移自由基聚合（SI-ATRP）方法，以带有双键的氨基葡萄糖为单体（GMAG），成功制备了新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料（pGMAG-SiO2），并将其用于麦芽七糖（DP7）、鸡卵清蛋白（OVA）的N-糖链及人血浆中糖蛋白N-糖链的富集。SI-ATRP 方法可以在硅胶填料表面原位接枝高密度的聚合物，形成致密的亲水聚合物层。由于聚糖结构含有大量的羟基，在保持了硅胶填料较好的机械强度的同时，显著提高了填料的亲水性，有利于N-糖链的富集。本文以DP7 和OVA 的N-糖链为研究对象，考察了pGMAG-SiO2填料对N-糖链的富集效果，并将该填料用于人血浆中糖蛋白N-糖链的富集，共鉴定到47 种糖型。以上结果说明该填料可用于复杂生物样本中蛋白质N-糖链的高选择性富集，并有助于提高糖蛋白质组数据的全面性。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

OVA 和胰蛋白酶（Trypsin，15 276 u／mg）购自美国Promega 公司；N-糖苷酶F（PNGase F）购自英国New England Biolabs 公司；2，5-二羟基苯甲酸（DHB）、三氟乙酸（TFA）、甲酸（FA）、DP7、三甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯三胺、氨基葡萄糖盐酸盐、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-APTES）、氰基硼氢化钠、α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）和5-甲氧基水杨酸均购自美国Sigma 公司；硅球（粒径10 μm，孔径20 nm）购于天津艾杰尔公司；去离子水由Milli-Q A10 纯水系统制备；其余试剂均为国产分析纯。人血浆由中国人民解放军空军总医院提供。

扫描电子显微镜（S4800 Field-Emission SEM）：工作电压为20 kV；热重分析仪（SDT Q600，美国TA 公司）：升温速率5 ℃／min，氮气保护。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）仪（4800 Proteomic Analyzer，AB SCIEX）用于糖链检测：数据采集模式为正离子反射模式（positive reflector mode），加速电压20 kV，扫描范围为m／z 900 ～3 000，激光能量为6 000，总激光发射脉冲次数为1 000，将质谱图平均累计得到最终的质谱图。在进行数据采集之前，用马心肌红蛋白（Myo）的胰蛋白酶酶解肽段作为标准物校准仪器，使其绝对准确度达到0.1 Da，相对标准偏差达到10×10-6（10 ppm）。用Date Explorer Software 4.5进行谱图分析。基质为10 mg／mL 2，5-二羟基苯甲酸的50% （v／v）乙腈和50% （v／v）的0.1% 三氟乙酸溶液。取1 μL 待分析样品置于不锈钢板上使其自然风干，然后取1 μL 基质使样品充分结晶以待分析。将MALDI-TOF MS 生成的原始文件上传到由Haslam 等［14］编写的软件GlycoWorkbench，以确定糖链结构。将实验所得的质谱峰和Carbbank 库（美国复合糖研究中心（CCRC）创建）中收录的糖链的m／z 值进行匹配，得到糖链的结构，最后将所有匹配的糖型结构采用报告的形式呈现。

1.2 实验方法

1.2.1 pGMAG-SiO2的制备

首先制备GMAG，具体步骤如下：将1 mL GMA 和0.2 mol／L 硫酸混合后置于50 ℃水浴中加热4 h，加入终浓度为10 mmol／L 的高碘酸钠，室温下避光放置1 h。将处理好的GMA 逐滴加到溶解有0.4 g 氢氧化钠和2 g 氨基葡萄糖盐酸盐的20 mL 甲醇中，同时加入10 mmol NaBH3CN，搅拌直至溶液变为黄色透明液，减压蒸干至膏状，密闭充氮气后放置于4 ℃下保存。

然后制备pGMAG-SiO2杂化填料，具体步骤如下：引发剂制备参照文献［15，16］中描述的步骤进行。在硅胶颗粒（粒径10 μm，孔径20 nm）中加入1 mol／L 的盐酸（按1 g 硅胶颗粒中加入10 mL 1 mol／L 盐酸的比例），超声处理30 min，浸泡12 h 后用去离子水洗涤数次，直至pH 为中性。离心去除液体并将所得硅胶颗粒在80 ℃真空干燥箱中放置3 h。将处理后的硅胶与引发剂混合过夜，然后用甲醇清洗数次，加入ATRP 反应液（0.01 mol／L CuCl，0.015 mol／L N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯三胺，0.001 mol／L CuCl2和2 mol／L GMAG），室温下反应24 h。聚合反应结束后，用甲醇清洗以去除未反应的反应物和其他杂质。将制备得到的pGMAG-SiO2杂化填料在真空下干燥后备用。

1.2.2 糖蛋白N-糖链的制备

标准糖蛋白：将0.1 mg OVA 溶解于0.1 mL 50 mmol／L NH4HCO3溶液（pH 7.8）中，在95 ℃水浴中加热10 min，冷却后加入PNGase F 酶（按0.1 mg蛋白质对应10 U 酶的比例），于37 ℃下放置12 h，得到其N-糖链。

人血浆样品：将人血浆在4 ℃、16 000 g 离心力下离心30 min 除脂。然后使用50 mmol／L NH4HCO3溶液将其蛋白质的质量浓度稀释至1 mg／mL。余下操作同标准糖蛋白N-糖链的制备。

1.2.3 pGMAG-SiO2杂化填料富集纯化N-糖链

使用pGMAG-SiO2填料自制固相萃取柱用于DP7 寡糖和N-糖链的富集，主要操作步骤如下：称取1 ～2 mg pGMAG-SiO2填料，用乙腈分散后装填于200 μL 的tip 头中；将填充的小柱活化平衡好之后，将糖链用乙腈／水（80 ∶20，v／v）溶液溶解，慢慢注入小柱中；随后用100 μL 乙腈／水／甲酸（80 ∶20 ∶0.1，v／v／v）淋洗小柱3 次以去除蛋白质和其他非极性物质；最后用乙腈／水／甲酸（10 ∶90 ∶0.1，v／v／v）洗脱剂洗脱糖链，并将洗脱液置于MALDI-TOF MS 样品靶上，加入基质进行质谱分析。

2 结果与讨论

2.1 pGMAG-SiO2 的制备与表征

2.1.1 pGMAG-SiO2的扫描电镜谱图

首先，将单体GMA 上的环氧基氧化为醛基，利用醛基和氨基葡萄糖上氨基的共价反应制备带有双键可用于ATRP 反应的含糖单体GMAG。然后，合成SI-ATRP 引发剂，该引发剂一端为ATRP 引发剂，另一端为能与硅胶填料表面键合的硅烷偶联剂，可以利用硅烷偶联剂与硅胶填料表面的硅羟基共价连接，将SI-ATRP 引发剂固定在硅胶颗粒表面。最后，以GMAG 为单体，氯化亚铜为催化剂，N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯三胺为配体，在硅胶颗粒表面引发ATRP 反应原位生成葡萄糖聚合物链，制备新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料pGMAGSiO2。利用扫描电镜对聚合物修饰的硅胶颗粒和没有处理的硅胶颗粒进行表征。从图1 中可以看出，未经修饰的硅胶颗粒表面比较光滑，经过聚合物修饰之后的颗粒表面粗糙度增加。证明通过SI-ATRP 方法在硅胶颗粒表面成功修饰了亲水聚合物。

图1 （a）未经修饰的硅胶颗粒和（b）pGMAG-SiO2颗粒的扫描电镜图Fig.1 SEM images of （a）bare silica particles and （b）pGMAG-SiO2 particles

2.1.2 热重分析

pGMAG-SiO2填料包含可热分解的聚合物层和不可热分解的硅胶颗粒两部分。从图2 可看出，未经任何处理的硅胶填料在40 ～990 ℃温度范围内随热处理温度的提高无明显的质量损失；而经亲水聚合物修饰的硅胶杂化填料随热处理温度的提高，质量损失高达20%，这是硅胶上的pGMAG 聚合物热分解所导致的。这证明通过SI-ATRP 法可以在硅胶填料表面原位聚合生成大量的亲水聚合物pGMAG。大量羟基的存在增强了pGMAG-SiO2杂化填料的亲水性，从而提高了其对N-糖链的保留作用，有望对N-糖链有高效的富集。

图2 未经修饰的硅胶填料和pGMAG-SiO2 杂化填料的热重分析图Fig.2 Thermogravimetric analysis of bare silica microparticles and pGMAG-SiO2 packing

2.2 pGMAG-SiO2 对糖蛋白N-糖链的富集

基于pGMAG-SiO2杂化填料的蛋白质N-糖链富集路线如图3 所示。将蛋白质变性后，使用PNGase F 酶将糖链释放，随后用pGMAG-SiO2杂化填料对N-糖链进行富集，将蛋白质、多肽和其他杂质淋洗去除后，洗脱糖链并进行质谱鉴定。

图3 基于pGMAG-SiO2 杂化填料的糖蛋白N-糖链富集路线图Fig.3 Schematic diagram of N-glycan enrichment by pGMAG-SiO2 packing

2.2.1 pGMAG-SiO2对标准寡糖样品的富集

首先使用标准寡糖DP7 评价了该亲水填料在微量糖链富集鉴定中应用的可能性。按照图3 所示流程，将1 μg DP7 上样、淋洗、洗脱后进行MALDITOF MS 鉴定。富集前DP7 的质谱绝对信号强度为2.4×104（m／z 1 175.0）（见图4a）；使用乙腈／水／甲酸（80 ∶20 ∶0.1，v／v／v）淋洗之后，淋洗液在m／z 1 175处只有极弱的质谱峰（见图4b）；使用乙腈／水／甲酸（10 ∶90 ∶0.1，v／v／v）洗脱后，在m／z 1 175 处观测到较强的质谱峰信号（见图4c），且信号强度和富集前相差不多。这说明糖链可以在高比例的有机相条件下通过亲水相互作用保留在该亲水性硅胶杂化填料上，在高比例水相的条件下被洗脱，因此可以浓缩糖链样品提高质谱检测的信号强度。同时我们也考察了糖链在pGMAG-SiO2填料上的回收率，通过测定不同浓度的DP7 在m／z 1 175 处对应的质谱峰面积，建立标准曲线，使用外标法计算得到pGMAGSiO2杂化填料对DP7 的回收率为91.2%，说明pGMAG-SiO2杂化填料对糖链具有较高的回收率。

图4 DP7 经（a）pGMAG-SiO2 杂化填料富集前、（b）淋洗液和（c）富集后的MALDI-TOF MS 谱图Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of DP7 （a）before enrichment，（b）washing and （c）after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

2.2.2 pGMAG-SiO2对标准糖蛋白N-糖链的富集

为了进一步评价pGMAG-SiO2杂化填料在糖蛋白N-糖链富集检测中的应用，我们对标准糖蛋白上释放的N-糖链进行了富集检测。使用PNGase F释放OVA 标准糖蛋白的N-糖链，经pGMAG-SiO2杂化填料富集之后进行MALDI-TOF MS 分析。从图5a 可以看出，未经任何富集处理只能检测到14个糖链对应的质谱峰，且信号强度较弱，信噪比（S／N）较低。经过pGMAG-SiO2杂化填料富集后可以鉴定到21 个糖链（对应的糖型结构见表1），与文献［17］报道数量一致，并且信号强度较强，S／N 较高（见图5b）。对于富集前、后均检测到的糖型信号，富集后的信号强度为富集之前的1 ～9.7 倍（见表1）。以上数据证明了pGMAG-SiO2杂化填料由于包裹了致密的葡萄糖聚合物层，具有较强的亲水性，对不同糖型的N-糖链均有良好的保留能力，适用于N-糖链的无偏性富集鉴定。

图5 OVA 的N-糖链经pGMAG-SiO2（a）富集前和（b）富集后的MALDI-TOF MS 谱图Fig.5 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from OVA （a）before and （b）after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

表1 pGMAG-SiO2 富集前、后质谱鉴定到的OVA 的N-糖链的糖型Table 1 Identified N-glycoforms of OVA before and after enrichment by pGMAG-SiO2

2.2.3 pGMAG-SiO2用于人血浆中糖蛋白N-糖链的富集

已经有文献报道，人血浆中糖蛋白的糖型结构改变和多种癌症的发生有密切关系，例如乳腺癌、前列腺癌及肝癌等［18-20］。因此鉴定人血浆中糖蛋白的N-糖链结构有利于发现多种癌症诊断生物标志物，为这些疾病的临床研究及药物研发提供有价值的数据。对血浆糖蛋白经PNGase F 酶解释放的N-糖链直接进行MALDI-TOF MS 检测，只能鉴定到11 种糖型，并且信号强度较差，S／N 较低（见图6a）。使用本文制备的新型核壳型pGMAG-SiO2杂化填料富集后，可以鉴定到47 种糖型（见图6b），包含了N-糖链的3 种糖型构型（高甘露糖型、复合型和杂合型），比文献报道的42 种糖型有所增加［21］。而且信号强度和S／N 也得到显著改善，例如，MALDI-TOF MS 谱图中的m／z 1 647.7 质谱峰对应的是IgG 释放的N-糖链Hex4HexNAc4Fuc1，经过该亲水填料富集之后S／N 提高了16 倍。N-糖链质谱信号和信噪比的提高得益于该亲水杂化填料能够有效浓缩富集N-糖链，且在富集的同时又能够有效去除血浆样品中的非极性杂质（如蛋白质及多肽等），降低了其对N-糖链质谱信号的抑制。以上结果进一步说明了该亲水杂化填料可以用于复杂生物样本中N-糖链的高效且无偏性富集。

图6 人血浆糖蛋白N-糖链经pGMAG-SiO2（a）富集前和（b）富集后的MALDI-TOF MS 谱图Fig.6 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from human plasma proteins

3 结论

采用SI-ATRP 反应在硅胶表面原位生成亲水葡萄糖聚合物层，成功制备了新型核壳型葡萄糖聚合物-硅胶杂化填料。由于葡萄糖亲水聚合物的修饰，该填料具有高度亲水性，特别适合亲水作用色谱（HILIC）模式下糖链的富集分离。该杂化填料已被成功应用于标准糖蛋白和复杂生物样本中糖蛋白的N-糖链富集，从人血浆糖蛋白中成功富集鉴定到47种糖型，显示了其在糖蛋白质组学研究中的应用潜力。

［1］ Zaia J. Nat Methods，2011，8（1）：55

［2］ Lau K S，Partridge E A，Grigorian A，et al. Cell，2007，129（1）：123

［3］ Balog C I A，Stavenhagen K，Fung W L J，et al. Mol Cell Proteomics，2012，11（9）：571

［4］ Robajac D，Masnikosa R，Filimonovic D，et al. J Med Biochem，2012，31（3）：205

［5］ Anderson N L，Anderson N G. Mol Cell Proteomics，2002，1（11）：845

［6］ Ruiz-May E，Hucko S，Howe K J，et al. Mol Cell Proteomics，2014，13（2）：566

［7］ Ruiz-May E，Catalá C，Rose J K. Methods Mol Biol，2014，1072：633

［8］ Xu Y，Bailey U M，Punyadeera C，et al. Rapid Commun Mass Spectrom，2014，28（5）：471

［9］ Zhang Y T，Ma W F，Li D，et al. Small，2014，10（7）：1379

［10］ Wan H H，Yan J Y，Yu L，et al. Analyst，2011，136（21）：4422

［11］ Ma C，Pan Y T，Zhang Q，et al. Chinese Journal of Chromatography （马成，潘一廷，张琪，等. 色谱），2013，31（11）：1057

［12］ Regnier F E，Noel R. J Chromatogr Sci，1976，14：316

［13］ Jackowska M，Bocian S，Buszewski B. Analyst，2012，137（19）：4610

［14］ Tissot B，Ceroni A，Powell A K，et al. Anal Chem，2008，80（23）：9204

［15］ Song Z F，Zhang Q L，Zhang Y J，et al. Chinese Journal of Chromatography （宋子凤，张庆林，张养军，等. 色谱），2012，30（6）：549

［16］ Fan C，Song Z F，Qin W J，et al. Chinese Journal of Chromatography （范超，宋子凤，秦伟捷，等. 色谱），2013，31（5）：423

［17］ Lattova E，Perreault H N，Krokhin O，et al. J Am Soc Mass Spectrom，2004，15（5）：725

［18］ Zhong Y，Shen S，Zhou Y D，et al. Med Oncol，2014，31（3）：864

［19］ Vermassen T，Speeckaert M M，Lumen N，et al. Clin Chim Acta，2012，413（19／20）：1500

［20］ Lai Q，Avolio A W，Graziadei I，et al. J Hepatol，2014，60（6）：1332

［21］ Bereman M S，Young D D，Deiters A，et al. J Proteome Res，2009，8（7）：3764