高效液相色谱-串联质谱法同时测定人尿液中7 种邻苯二甲酸酯代谢物

高 慧， 许媛媛，， 孙 丽， 金忠秀， 胡海婷，盛 杰， 任玲玲， 陶芳标，*

（1. 安徽医科大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学系，安徽 合肥230032；2. 安徽人口健康与优生省级实验室，安徽 合肥230032）

邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一类具有软化作用的化合物，全球每年消耗量高达几百万吨［1］。主要用作塑化剂，广泛用于食品包装、医疗器械、家居装饰、儿童玩具以及个人护理产品中［2］。PAEs 在使用过程中极易释放，已普遍存在于大气、水体、食物等多种环境介质中。人类主要通过消化道、呼吸道、静脉注射和皮肤接触等途径暴露［2］，在体内迅速水解为生物活性增强的单酯，可进一步发生氧化或羟基化反应［3，4］。这些代谢产物经内源性葡萄糖醛酸化以增加水溶性，主要经尿液排出体外［3］。因此，目前尿液中代谢物常作为相应PAEs 的生物标志物，评估近期暴露水平［3，4］。研究表明，PAEs 具有潜在的生殖和发育毒性、神经毒性［5］、甲状腺毒性以及增加儿童哮喘和过敏风险等，危害人类健康。可见，建立准确、灵敏的暴露评估方法，对今后的健康研究和卫生政策制定至关重要。

国内对饮食［6-8］、化妆品［9］、土壤［10］等样品中PAEs 的检测方法报道较多，但尿液中PAEs 代谢物的实验检测方法多为国外学者建立，国内报道较少［11］。目前常见的人类尿液PAEs 代谢物检测方法有气相色谱-质谱（GC-MS）法、高效液相色谱（HPLC）法［12-15］和高效液相色谱-串联质谱（HPLCMS／MS）法等［11，16］。本实验室建立了同时检测尿液中7 种PAEs 代谢物的高效液相色谱-电喷雾-串联质谱（HPLC-ESI-MS／MS）分析方法，操作简便、结果准确、灵敏度高、重现性好，为今后评价人类多种PAEs 暴露水平及健康科学研究奠定了实验基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1200 HPLC-6410 MS Agilent 液相色谱／质谱联用仪，配电喷雾离子源（美国Agilent 公司）；Oasis®MAX（3 mL／60 mg）SPE 小柱（美国Waters 公司）；N-EVAP-122 氮吹仪（美国Organomation 公司）；美国Millipore 纯水仪；SK-1 快速混匀器（金坛市科技仪器有限公司）；HZS-H 电热恒温水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）。

LC-MS 级甲醇、乙腈和水均购自美国Honeywell 公司；β-葡萄糖醛酸酶、LC-MS 级无水乙酸、分析纯醋酸铵均购于美国Sigma-Aldrich 公司；分析纯氨水、色谱级无水甲酸均购于西陇化工股份有限公司。

邻苯二甲酸酯标准品原液（100.0 mg／L，纯度≥99%）：邻苯二甲酸单甲酯（MMP 和13C-MMP）、邻苯二甲酸单乙酯（MEP 和13C-MEP）、邻苯二甲酸单丁酯（MBP 和13C-MBP）、邻苯二甲酸单苄酯（MBzP 和13C-MBzP）、邻苯二甲酸-单-乙基己基酯（MEHP 和13C-MEHP）、邻苯二甲酸-单-（2-乙基-5-羟基己基）酯（MEHHP 和13C-MEHHP）和邻苯二甲酸-单-（2-乙基-5-酮基己基）酯（MEOHP 和13CMEOHP），均购于美国剑桥同位素实验室。

1.2 溶液的配制

1.2.1 标准储备液

准确量取MMP、MEP、MBP、MBzP、MEHP、MEHHP 和MEOHP 及其13C 标记单酯的标准品原液1 mL 于10 mL 容量瓶中，乙腈定容，配制为10.0 mg／L 的单标准储备液和内标单标准储备液。

1.2.2 标准工作液配制

准确量取10.0 mg／L 各单标准储备液1 mL 于同一10 mL 容量瓶中，乙腈定容，配制1.0 mg／L 的混合标准工作液；同时配制1.0 mg／L 的内标混合标准工作液，操作步骤同上。

1.2.3 内标定容液配制

准确量取1.0 mg／L 内标混合标准工作液1 mL于干净的50 mL 容量瓶中，加入LC-MS 级乙腈9 mL，LC-MS 级水定容，配制为20.0 μg／L 的混合内标定容液。

1.2.4 系列标准溶液的配制

准确量取1.0 mg／L 混合标准工作液2 mL 于10 mL 容量瓶中，加入0.2 mL 内标混合标准工作液（1.0 mg／L），LC-MS 级水定容，配制为200.0 μg／L的标准溶液；此后逐级稀释，采用20.0 μg／L 混合内标定容液定容，配制100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.2 μg／L 的系列标准溶液，保证溶液中13C-内标物浓度均为20.0 μg／L。

1.3 实验条件与方法

1.3.1 高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流动相：A 相为0.1% （v／v，下同）乙酸水溶液，B 相为0.1% 乙酸乙腈溶液。洗脱梯度：0 ～8 min，20%B ～50%B；8 ～13 min，50%B ～60%B；13 ～17 min，60% B；17 ～19 min，60% B ～90%B；19 ～21 min，90% B；21 ～23 min，90% B ～20% B；23 ～27 min，20% B。流速为0.2 mL／min；柱温35 ℃；连续自动进样，进样量为10 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源负离子模式（ESI-）；毛细管电压为4 000 V；雾化气压力为275.8 kPa，干燥气温度为300 ℃，流速为9.0 L／min；多反应监测（MRM）模式检测；碰撞气和载气均为高纯氮气。7 种PAEs 及其内标物的定量离子对、保留时间、碎裂电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 7 种邻苯二甲酸单酯及其内标的特征离子对、碎裂电压、碰撞能量和保留时间等质谱参数Table 1 Precursor and product ion transitions，fragmentors，collision energies and retention times （RT）of the native and labeled seven phthalate metabolites

1.3.3 尿液的收集与处理

孕妇晨尿收集于马鞍山市妇幼保健院，采用聚丙烯尿杯收集，经转速3 500 r／min 离心10 min 后，取上清液于聚丙烯尿管中，-80 ℃冰箱保存。实验时，取出冷冻储存的尿液，在室温条件下缓慢解冻，经转速3 500 r／min 离心10 min 后，取上清尿液1 mL 于玻璃试管中，分别加入200 μL 乙酸铵缓冲液（1 mol／L，pH 5.0）、50 Units β-葡萄糖醛酸酶和4 μL 内标混合工作液（1.0 mg／L），盖上玻璃盖，涡旋混匀后于37 ℃水浴振荡120 min。固相萃取小柱经3 mL 甲醇和3 mL 水活化后，将酶解处理后的尿样上样，再分别采用5% 氨水溶液、纯甲醇和2% 甲酸-40% 甲醇-水溶液淋洗，最后采用2% 甲酸-甲醇溶液洗脱。洗脱液经55 ℃水浴氮吹至微润后以0.2 mL 体积比为1 ∶4 的乙腈和水溶液定量复溶，供HPLC-MS／MS 分析。

2 结果与讨论

2.1 尿液前处理过程优化

2.1.1 酶添加量的优化

尿液中PAEs 代谢产物以游离态和葡萄糖醛酸结合态两种形式存在，且部分代谢物的结合态所占比例较高，因此对样品进行去葡萄糖醛酸基的酶解处理十分必要。根据文献［11］，确定解离酶为β-葡萄糖醛酸酶，酶解温度为37 ℃。文献报道的解离酶温育时间60 ～120 min、酶解环境pH 5.0 ～7.0、酶适宜用量各不相同。选取一份志愿者晨尿，分别将尿液酸化为pH 5.0、6.0、6.5 和7.0，添加足够酶量后温育120 min，发现pH 5.0 的环境中，酶解效果最佳（见图1）。确定尿液的适宜酸环境为pH 5.0 后，在另一志愿者各等份尿液中各加入酶量0、5、50 和100 Units 分别温育60、90、120 min 进行酶解，以MBP 测定结果为指标。结果（见图2）发现，当酶添加量为50 Units 并温育120 min 时，与酶添加量为100 Units 的MBP 测定结果无统计 学 差 异（p ＝0.070），综合考虑时间和成本，确定样品酶解处理的酶适宜用量为50 Units，温育时间为120 min。

图1 志愿者尿液在pH 5.0 ～7.0 酸化处理后MBP、MEHP、MEHHP 和MEOHP 的质量浓度（μg／L）Fig.1 Mass concentrations of MBP，MEHP，MEHHP and MEOHP in volunteer urine after acidification at pH 5.0-7.0 levels

图2 志愿者尿液在不同的酶添加量和温育时间处理后MBP 的质量浓度Fig.2 Mass concentrations of MBP in volunteer urine after processing with various amounts of glucuronidase enzyme and at various incubation times

2.1.2 净化条件优化

通过比较Waters OASIS®HLB 柱（3 mL／60 mg）和MAX 柱（3 mL／60 mg）的萃取效果，确定采用MAX 柱进行固相萃取。这是由于MAX 柱为混合阴离子交换柱，具有阴离子交换和反相吸附两种模式，因此本次实验采用了3 个步骤进行淋洗。在上样后采用5% 氨水（淋洗液A）过柱，促进酸性的邻苯二甲酸单酯化合物离子化，提高其在MAX 柱的保留水平；再用纯甲醇（淋洗液B）淋洗减少有机杂质；2% 甲酸-40% 甲醇-水溶液（淋洗液C）淋洗去除酸性杂质且调节柱的酸碱度，便于洗脱；最后采用2% 甲酸-甲醇溶液洗脱。通过比较不同使用量的洗脱剂（1 ～6 mL），发现洗脱剂≥3 mL 时洗脱效果相似；考察淋洗液C 中不同甲醇含量（0 ～50% ）的淋洗效果，发现使用20% ～40% 甲醇的淋洗液C 时，7种PAEs 代谢物的回收率较好。为了更多地去除杂质，认为选择甲醇含量为40% 的淋洗液C 最合适（见图3）；最后比较了淋洗液A、B 和C 不同配比的淋洗效果，发现采用1 mL 淋洗液A、1.5 mL 淋洗液B 和1 mL 淋洗液C 的淋洗程序时回收率最佳（见图4）。

2.1.3 样品处理过程优化

为了避免塑料产品中塑化剂迁移污染，尿液处理材料均为玻璃制品，现洗现用。经重铬酸洗液过夜浸泡至少12 h，采用高纯水反复洗涤后，用LCMS 级甲醇润洗两遍，高温180 ℃烘1 h 备用。每一批次样品处理的同时，采用LC-MS 级水做两个平行空白样品，用于本底值扣除，以降低批次间的误差。

图3 采用不同甲醇含量（0 ～50%）的淋洗液淋洗后7 种PAEs 代谢物的加标回收率Fig.3 Recoveries of the seven phthalate metabolites after washing by the solutions of 0-50% methanol-2% acetic acid in water

图4 采用不同体积配比的5%氨水溶液、纯甲醇和2%甲酸-40%甲醇-水溶液淋洗程序的7 种PAEs 的加标回收率Fig.4 Recoveries of the seven phthalate metabolites after processing with various eluting procedures

2.1.4 内标法定量

采用外标法定量检测时，7 种PAEs 代谢物的回收率极低（数据略）；选择理化特征相似的13C-同位素作为内标物，不仅能够准确提供定性和定量信息，而且能有效避免样品基质影响，校正方法中出现的误差，显著提高检测方法的稳定性、准确度和精密度。

2.2 液相色谱及质谱条件的优化

根据国内外研究发现，PAEs 代谢物在苯基柱上的峰形及分离效果更好［15，17］，因此本实验室采用ZORBAX SB-Phenyl 柱进行分离。PAEs 代谢物是一类具有极性差异的羧基化合物，在流动相中加入一定量的乙酸，抑制羧基解离，可促进其在反相柱上的保留。采用含0.1% 乙酸的乙腈-水体系作为流动相，通过梯度洗脱改变流动相的极性使混合物得到更好的分离。在8.0 ～17.0 min 时，0.1% 乙酸-乙腈溶液的浓度梯度增加缓慢，使MEOHP、MEHHP、MBP 和MBzP 4 种难分离代谢物的分离效果较好。用乙腈配制质量浓度为1.0 mg／L 的7 种PAE 代谢物单标准溶液，采用HPLC-MS／MS 自动优化，获取灵敏度高、稳定性好的MRM 检测离子对，优化碎裂电压和碰撞能量等质谱参数，结果见表1。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围、检出限与定量限

准确量取适量的PAEs 混合标准工作液（1.0 mg／L），用乙腈-水（2 ∶8，v／v）稀释，获得质量浓度分别为0.2、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 和200.0 μg／L 的系列标准溶液（13C-内标质量浓度均为20.0 μg／L）。实验表明，邻苯二甲酸单酯在0.2～200.0 μg／L 的质量浓度范围内定量离子的相对峰面积比值（y）与质量浓度（x）的线性关系良好，相关系数r≥0.999 76，检出限（LOD，S／N＝3）和定量限（LOQ，S／N ＝10）范围分别是13.43 ～80.21 ng／L 和44.77 ～267.37 ng／L（见表2）。

表2 尿液中7 种PAEs 代谢物的线性范围、回归方程、检出限和定量限Table 2 Linear ranges，regression equations，LODs and LOQs of the seven phthalate metabolites in human urine

2.3.2 加标回收率和精密度试验

取空白尿液数等份，分别加入不等量的7 种PAEs 混合标准溶液，配制成加标量为5.0、50.0 和200.0 μg／L 的样品，每个浓度平行6 个样品，按照前述方法处理和分析样品，计算回收率。空白尿液及加标尿液（加标量为200 μg／L）的HPLC-MS／MS总离子流图（TIC）和MRM 谱图见图5。

图5 （a）空白尿液及（b）加标尿液（加标量为200 μg／L）中7 种PAEs 代谢物的总离子流图（TIC）和MRM 谱图Fig.5 Total ion chromatograms （TIC）and MRM chromatograms of a mixture of the seven phthalate metabolites in （a）a non-spiked and （b）spiked （200 μg／L）human urines

分别在样品处理当日不同时间点和不同处理天数进样分析（n ＝6），计算日内和日间精密度。在每次进样结束后，将样品溶液更换密封垫密封，并于-20 ℃储存，以减少挥发和便于下次进样检测。回收率和精密度结果见表3。

表3 尿中7 种PAEs 代谢物在3 个加标水平的加标回收率、日内和日间精密度（n＝6）Table 3 Recoveries，inter-day and intra-day precisions of the seven phthalate metabolites in a urea sample at three spiked levels （n＝6）

2.4 实际样品检测

2014 年9 月以来，本实验室采用该方法对800份孕妇尿样进行了7 种PAEs 代谢物的检测，结果表明，除MBzP 检出率为81.5% 外，其他6 种PAEs代谢物的检出率均高于98.3%，如表4 所示。本方法具有良好的实用性，可应用于人类多种PAEs 暴露水平的评估检测。

表4 孕妇尿样中7 种PAEs 代谢物的检测结果Table 4 Detection results of the seven phthalate metabolites in pregnant urine samples

3 结论

本文建立了同时测定人尿液中7 种PAEs 代谢物的HPLC-MS／MS 分析方法。本文考察了酶的适宜酸环境、酶用量、酶解时间和淋洗程序等，采用同位素内标法定量。本方法操作简便，结果可靠，检出限低，重现性好，已应用于本实验室的生物样本检测，为今后人类PAEs 暴露评估和相关健康研究奠定了良好的实验基础。

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