超高效液相色谱-串联质谱法测定甜樱桃果皮中花青苷类物质

魏海蓉， 易锡斌， 谭 钺， 宗晓娟， 王甲威， 徐 丽， 刘庆忠*

（1. 山东省果树研究所，山东省果树生物技术育种重点实验室，山东 泰安271000；2. 山东农业大学园艺科学与工程学院，山东 泰安271018）

甜樱桃果实色泽艳丽，营养丰富，且具有一定的医疗保健价值，因而备受消费者的青睐。甜樱桃果实的红色主要决定于花青苷类物质的组成和含量［1］。花青苷是一种广泛存在于植物体中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，在植物体内主要呈现蓝色、紫色和红色［2］。甜樱桃果皮中的花青苷不仅使果实具有艳丽的色泽，而且在抗氧化［3］，抗肿瘤、防止冠状动脉心脏疾病、抵御病原体［4］和紫外辐射［5］等方面有重要的营养和药理作用。研究表明甜樱桃的红色品种比黄色品种的抗氧化能力强［6］。因此甜樱桃中花青苷的含量是决定其品质的重要因素之一。

目前国内外关于花青苷的研究主要集中在分离、鉴定、生物合成机理和保健功能等方面。关于花青苷的检测方法，目前常用紫外-可见分光光度法［7］、高效液相色谱法［8，9］和高效液相色谱-串联质谱法［10，11］。其中高效液相色谱-串联质谱法比其他方法在快速分离、准确定性和灵敏度等方面更具有优势。但到目前为止，有关甜樱桃的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）检测方法尚未见报道。本研究以甜樱桃成熟果实为研究对象，建立了UPLC-MS／MS 测定方法，利用多反应监测（MRM）模式对甜樱桃果皮中的花青苷组分进行了定性和定量分析，旨在为甜樱桃的品质评价和优异种质挖掘提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与试材

Triple Quad 4500 液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪，配电喷雾离子（ESI）源（美国AB SCIEX公司）；ELGAPURELAB Ultra 超纯水仪（英国ELGALabWater 公司）；AB-135 型电子分析天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；JA 5003B 型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；Centrifuge 5430R 型离心机（德国Eppendorf 公司）；TH-100BQX 型数控超声波清洗机（济宁天华超声电子仪器有限公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯）（德国Merck 公司）；甲酸（色谱纯）（天津科密欧化学试剂有限公司）；7 种花青苷标准物质为矢车菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，CAS：7084-24-4）、矢车菊素-3-芸香糖苷（cyanidin-3-rutinoside，CAS：18719-76-1）（Sigma公司）；芍药素-3-葡萄糖苷（peonidin-3-glucoside，CAS：6906-39-4）、芍药素-3-芸香糖苷（peonidin-3-rutinoside，CAS：27539-32-8）、天竺葵素-3-芸香糖苷（pelargonidin-3-rutinoside，CAS：33978-17-5）、矢车菊素-3-木糖苷（cyanidin-3-xyloside，CAS：29761-24-8）和飞燕草素-3-葡萄糖苷（delphinidin-3-glucoside，CAS：6906-38-3）（法国Extrasynthese 公司）。

甜樱桃样品：采自山东省果树研究所实验基地。

1.2 标准溶液的配制

精确称取各标准物质1.00 mg，分别用含0.1%（v／v，下同）甲酸的甲醇定容至10 mL，配成100 mg／L 的单标准储备液。分别取各单标准储备液100 μL 用含0.1% 甲酸的甲醇定容到10 mL，配成1 000 μg／L 的混合标准储备液。依次取0、0.1、0.3、0.5 和1.0 mL 上述混合标准储备液，用甲醇-0.1% 甲酸水溶液（2 ∶8，v／v）定容至10 mL，配成所需浓度的混合标准工作液，于4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

取1 ～2 mm 厚甜樱桃成熟果实的果皮0.5 g，加液氮研磨后，置于50 mL 离心管中，准确加入甲醇-0.1% 甲酸水溶液（2 ∶8，v／v）提取液15 mL，超声波振荡10 min，放入4 ℃冰箱中浸提24 h，然后于12 000 r／min 下离心15 min，收集上清液于50 mL 离心管中，待净化。

1.3.2 净化

AB-8 型大孔树脂的活化方法：用95% 乙醇浸泡24 h，过滤后用蒸馏水洗至无味；再用5% 氢氧化钠浸泡12 h，过滤后用蒸馏水洗至中性；最后用5%盐酸溶液浸泡12 h，过滤后用蒸馏水洗至中性，用蒸馏水浸泡，备用。

将活化完全的AB-8 型大孔树脂装入玻璃层析柱中，将待净化液上柱，流速为1.2 mL／min，待大孔树脂吸附饱和后，用蒸馏水淋洗去除水溶性维生素和可溶性糖类等极性小分子，然后用80% 乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，于35 ℃下旋转蒸发至浸膏状，用甲醇-0.1% 甲酸水溶液（2 ∶8，v／v）复溶并定容至2 mL，过0.22 μm 有机微孔滤膜，滤液压入2 mL 进样瓶，供UPLC-MS／MS 测定。

1.3.3 空白基质

样品被多次提取花青苷后其残渣为空白基质。

1.4 UPLC-MS／MS 条件

1.4.1 UPLC 条件

色谱柱为Phenomenex Kinetex（100 mm×4.6 mm，2.6 μm），柱温为35 ℃，进样量为5 μL，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液（含5 mmol／L 甲酸铵），流动相B 为100%甲醇，流速为0.3 mL／min。梯度洗脱程序：0 ～1.0 min，20% B；1.0 ～5.5 min，20% B ～70% B；5.5 ～7.8 min，70% B ～80% B；7.8 ～8.0 min，80% B ～20% B；8.0 ～9.0 min，20% B。

1.4.2 MS／MS 条件

电喷雾离子源，正离子电离，MRM 扫描模式，气帘气（curtain gas）压力275.79 kPa，离子化电压（ion spray voltage）＋4 500 V，离子源温度550 ℃，电喷雾气（ion source gas 1）压力344.74 kPa，辅助加热气（ion source gas 2）压力379.21 kPa，碰撞气（collision gas）压力55.16 kPa，驻留时间（dwell time）40 ms。7 种化合物优化后的母离子Q1、子离子Q3、解簇电压（declustering potential，DP）、碰撞能（collision energy，CE）、出口电压（collision cell exit potential，CXP）见表1。

表1 MRM 模式下7 种花青苷类物质的UPLC-MS／MS 优化条件Table 1 Optimized UPLC-MS／MS parameters for the analysis of the seven anthocyanins in MRM mode

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

花青苷极性较强，当提取溶剂的极性和花青苷极性相近时，花青苷在提取溶剂中的溶解性最好，溶出率最大［12］。文献［13］中采用的花青苷提取溶剂体系有盐酸／甲醇／水、盐酸／乙醇／水、甲酸／甲醇／水、甲酸／乙醇／水、酒石酸／乙醇／水和10% 柠檬酸水溶液等。花青苷在较强的酸性条件下相对稳定并且呈色效果好［14］。因此，本实验分别以甲醇、乙醇和丙酮分别与盐酸、乙酸和甲酸组成的酸性混合溶液为提取剂进行提取，采用分光光度计测定总花青苷的相对含量，以比较以上9 种提取剂的提取效果。结果发现，不同溶剂的提取效果差异较大，盐酸与甲醇、乙醇和丙酮组成的酸性提取液的提取效果整体好于甲酸和乙酸与3 种有机溶剂组成的酸性提取液（见图1）。其中，0.1% （v／v，下同）盐酸甲醇的提取效果最好。因此，本实验采用0.1% 盐酸甲醇作为甜樱桃果皮中花青苷的提取溶剂。

2.2 净化条件的优化

图1 不同溶剂提取甜樱桃中花青苷类物质的效果Fig.1 Extraction efficiency of different solvents for the anthocyanins in sweet cherry

目前，花青苷类物质的纯化方法多采用大孔树脂法［15］。本实验比较了AB-8、HPD-100A 和HPD-450A 3 种大孔树脂对甜樱桃果皮中花青苷的静态吸附和解吸效果。结果表明，AB-8 对花青苷类物质的吸附作用最强，吸附率为81.48%；HPD-450A 的吸附作用次之，吸附率为77.36%；HPD-100A 的吸附作用最弱，吸附率为62.76%。AB-8 和HPD-100A 对花青苷的解吸效果差异不明显，分别为73.58% 和74.30%；HPD-450A 的解吸效果较差，仅为62.34%。综合考虑3 种大孔树脂的吸附和解吸效果，本实验选择AB-8 作为花青苷类物质的净化吸附剂。

2.3 UPLC 条件的优化

花青苷类物质的极性较大，文献［16，17］中目标化合物在C18 柱上能够很好地分离。本实验采用Phenomenex Kinetex 色谱柱分离，比较了甲醇和乙腈、水和0.1% 甲酸水溶液作为流动相的分离效果。结果表明，甲醇的分离度优于乙腈，0.1% 甲酸水溶液优于水。实验在0.1% 甲酸水溶液中加入5 mmol／L 甲酸铵后，峰形得到明显改善，灵敏度提高。因此，流动相A 采用含5 mmol／L 甲酸铵的0.1% 甲酸水溶液，流动相B 采用甲醇，进行梯度洗脱。在此条件下，7 种化合物能够得到较好的分离和检测，总离子流图见图2a。

2.4 MS／MS 条件的优化

本实验根据花青苷类物质的分子结构特征，在电喷雾正离子模式下，对毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂温度、脱溶剂气压力和锥孔气压力等质谱参数进行了优化。优化后进行母离子Q1 扫描，7 种化合物的母离子均以［M＋H］＋形式存在，其m／z 分别为595.2、449.2、463.3、609.2、579.2、419.2 和465.1（见表1）。确定母离子后，再对母离子进行二级质谱扫描，从而得到子离子信息和碰撞能量。每种物质选择3 个信号较强的子离子与母离子组成检测离子对，采用MRM 检测模式对待测物进行定性和定量检测。7 种花青苷的选择离子谱图见图2。

2.5 线性范围、检出限和定量限

用0.1% 甲酸甲醇溶液将7 种花青苷配制成质量浓度分别为0、10、30、50 和100 μg／L 的混合标准溶液，在优化的UPLC-MS／MS 条件下进行测定。以定量离子峰面积（y）对质量浓度（x，μg／L）做标准曲线。结果显示，7 种化合物的线性相关系数（r2）为0.996 4 ～0.999 3（见表2），表明各化合物在0 ～100 μg／L 范围内线性关系良好，能满足检测需求。采用在空白基质中添加目标化合物的方法，依据色谱峰3 倍信噪比确定检出限，以10 倍信噪比确定本方法的定量限，结果见表2。

图2 7 种花青苷类物质标准溶液（10 μg／L）的总离子流图和MRM 谱图Fig.2 Total ion current chromatogram and select ion chromatograms of the seven anthocyanins （10 μg／L）

表2 7 种化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients （r2），limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the seven anthocyanins

2.6 加标回收率

以甜樱桃果皮提取液为检测试样，根据各化合物的背景值，分别添加3 种不同浓度的7 种花青苷类物质进行加标回收率实验，每个添加水平重复测定6 次，结果见表3。7 种花青苷类物质的加标回收率为97.2% ～105.4%，相对标准偏差（RSD）为1.9% ～5.8%，说明本方法重复性好，准确度高，符合检测要求。

表3 甜樱桃品种“美早”果皮中7 种花青苷类物质的加标回收率和相对标准偏差（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）for the seven anthocyanins spiked in the peel of“Tieton”sweet cherry fruits（n＝6）

2.7 实际样品的测定

采用本文建立的方法对甜樱桃红色品种“美早”和纯黄色品种“13-33”的成熟果实样品进行了定性和定量检测。从红色品种“美早”中共检测出矢车菊素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-芸香糖苷、天竺葵素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3-木糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷7 种花青苷类物质，其含量分别为742.5、582.5、10.1、14.8、34.2、4.3 和14.2 mg／kg。黄色品种“13-33”中仅检测出矢车菊素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-木糖苷4 种花青苷类物质，其含量仅分别为3.3、5.0、1.2 和1.1 mg／kg。可见不同品种的甜樱桃中花青苷类物质的含量差异非常大。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱多反应监测模式对甜樱桃果皮中的花青苷类物质进行定性和定量分析的方法。实验结果表明，该方法可以快速、准确地对甜樱桃果皮中的花青苷类物质进行定性及定量测定。通过样品测定发现，不同颜色的甜樱桃品种中花青苷类物质组分和含量差异很大，红色甜樱桃品种中含有丰富的花青苷类物质，而黄色品种中花青苷类物质含量极少。

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