超高效液相色谱-线性离子阱／静电场轨道阱高分辨质谱直接分析葡萄酒中38 种多酚类化合物

2015-12-26张协光郑彦婕曾泳艇刘文丽

色谱 2015年6期

张协光，郑彦婕，曾泳艇，刘文丽

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518109）

葡萄酒含有丰富的有机酸、糖类、氨基酸和较多的抗氧化剂（如多酚化合物）。多酚化合物与葡萄的品种、气候、地理因素、栽培模式及酿造工艺息息相关，具有良好的抗氧化活性，能消除或对抗自由基，有助于抗衰老以及预防各类疾病［1-3］，因此，研究葡萄酒中多酚类化合物的分析方法具有重要的意义。

葡萄酒中多酚化合物的检测方法主要有比色法［4］，气相色谱-质谱联用法［5］，高效液相色谱法［6-11］，高效液相色谱-紫外、质谱双检测器检测［12］，高效液相色谱-电化学、紫外双检测器检测法［13］。比色法无法区分每种化合物，气相色谱-质谱法需要衍生，步骤复杂，而液相色谱法因其选择性好逐渐成为主流方法，但是多种化合物的有效分离仍然是难点。Castellari 等［7］采用RP C18 柱分离17 种多酚化合物，Goncalves 等［8］采用T3 柱在10 min 内分离16 种多酚化合物，Torre 等［12］采用C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）分离，通过紫外检测器与质谱检测器串联的方法同时检测24 种多酚类化合物。但是这些方法都不是特别理想，葡萄酒基体复杂，含有的多酚化合物性质相似，分离困难，紫外吸收集中在280 ～320 nm 之间，有时需要用到复杂的衍生［5］、固相微萃取［8］、固相萃取［9］、液液萃取［10，11，13］等传统技术，造成多酚含量的损失与变化，这些都是多酚类化合物分析的难点。

线性离子阱／静电场轨道阱组合式高分辨质谱（LTQ／Orbitrap MS）兼有离子阱和高分辨质谱平行检测的能力，离子阱的多级质谱可获得结构碎片，高分辨质谱可获得精确质量数，这些技术的结合为分析复杂混合物提供了一种耐用和可靠的方式，能成功鉴定和分析待测化合物的结构，对未知物进行筛查。随着近年来高分辨质谱技术的应用，其综合识别技术得到快速发展，广泛应用于农药［14，15］、激素［16，17］、药物［18］、营养物质［19］、色素［20，21］等的分析。但将Orbitrap 高分辨质谱技术应用于葡萄酒中多酚化合物的检测尚未见报道。本文建立了超高效液相色谱-线性离子阱／静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-LTQ／Orbitrap MS）直接分析葡萄酒中38种多酚类化合物的方法，并应用于实际样品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Accela 超高效液相色谱仪，LTQ Orbitrap XL液相色谱／静电场轨道阱高分辨质谱联用仪，NIST MS Search 2.0 质谱库，均来自美国ThermoFisher公司。

甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck 公司），实验用纯水由Milli-Q 超纯水器（美国Millipore 公司）制备。

标准物质：38 种标准物质购自德国Sigma-Aldrich 公司，纯度≥98%。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量多酚类化合物标准品，用5% 甲醇水分别配制成有效质量浓度为100 mg／L的标准储备液，置于-18 ℃下保存。使用时，根据需要用初始流动相逐级稀释成不同质量浓度的系列混合标准工作液。

1.3 样品溶液的制备

样品采用直接进样法。样品在分析前室温避光保存，开瓶后，马上转移到棕色瓶中，迅速盖上避免氧化，置于-4 ℃下避光保存，以备重复分析。上样前取2 mL 样品过0.22 μm PES 滤膜。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil Gold C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国ThermoFisher 公司）；流动相A 为0.1% 甲酸水溶液，B 为0.1% 甲酸乙腈，流速200 μL／min；进样量10 μL。梯度洗脱程序：0.00～1.00 min，95% A；1.00 ～15.00 min，95% A ～40% A；15.00 ～16.00 min，40% A ～5% A；16.00～17.00 min，5% A；17.00 ～18.00 min，5% A ～95% A；18.00 ～20.00 min，95% A。

1.4.2 质谱条件

离子化方式：电喷雾电离负离子模式（ESI-）；喷雾电压：2.5 kV；蒸发温度：350 ℃；离子传输管温度：300 ℃；鞘气（N2）压力：345 kPa（即50 arb）；辅助气（N2）流量：1.7 L／min（即5 arb）；最大离子注入时间：一级全扫描300 ms，多级扫描150 ms。扫描方式：负离子扫描。通过外标法进行质量校正；扫描范围：m／z 50 ～1 000，扫描分辨率：30 000。数据依赖扫描范围：m／z 50 ～800。在分辨能力为7 500时分析全扫描中强度最高的离子做二级质谱扫描；碎裂方式：高能量碰撞（CID），能量35%。38 种多酚化合物的分析参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 样品的提取

葡萄酒的基质比较复杂，含有糖、酒、酸、无机盐等物质，采用二极管阵列（photo-diode array）检测器有时需要采用复杂而困难的前处理技术［8，9，11］，这容易造成提取不完全或由于氧化而导致样品含量测试不准。本文采用直接进样法［6，7，12］，由于葡萄酒中多酚化合物含量大部分在mg／kg 以上［6-10，12，13］，而直接进样的检出限在0.002 ～0.50 mg／kg，无需复杂的前处理，方法完全能满足检测要求，部分含量高的样品可用初始流动相稀释后再进样检测。

表1 38 种多酚化合物的UPLC-LTQ／Orbitrap MS 分析参数Table 1 Analytical parameters of UPLC-LTQ／Orbitrap MS for the 38 polyphenols

2.2 色谱／质谱条件的优化

本文采用Hypersil Gold C18 柱对多酚化合物标准工作溶液的分离条件进行了优化，发现多酚化合物均能达到良好的分离效果，该色谱柱1.9 μm粒度的填料能大大提升色谱柱的性能，获得更高的分离度。对流动相组成、甲酸浓度等条件进行了优化，结果表明，采用0.1% （v／v）甲酸水溶液和0.1% （v／v）甲酸乙腈作为流动相进行梯度洗脱，在最佳分离条件下，多酚化合物能够得到良好的基线分离，峰形合理，基质干扰小。色谱图如图1 所示。

二级质谱扫描比较了CID（collision induced dissociation，碰撞诱导解离）模式与HCD（higher energy collision dissociation，高能量碰撞解离）［19］模式，虽然采用HCD 可有效地避免1／3 效应［21］，但是其能量碰撞力度较小，并且多数多酚在“1／3”之间不存在碎片离子，比较发现CID 模式更能有效地碰撞产生子离子。以儿茶素（catechin）为例，见图2a，b。

图1 负离子扫描模式下38 种多酚化合物（1.0 mg／L）的特征离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 38 polyphenols （1.0 mg／L）in negative scan mode

图2 不同裂解模式及碰撞能量下儿茶素的二级质谱图Fig.2 MS2 spectra of catechin in different collision modes with different collision energies

因此，采用CID 模式，碰撞能量35% 作二级质谱图，将标准样品的二级质谱图导入NIST MS Search 2.0 中建立二级质谱库。实际样品分析中提取可疑物质的二级质谱图与数据库中标准样品的二级质谱图库进行比对，对可疑物质进一步确证。38种多酚标准品的碎片离子见表2。

2.3 方法的线性关系、检出限、回收率与精密度

提取精确质量数的色谱图噪声几乎可以忽略，本方法采用基质空白提取液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度，重复进样，根据测试结果的标准偏差确定检出限［17，20，21］。以化合物浓度（x，mg／kg）和准分子离子峰面积（y）绘制标准曲线，得到各化合物的线性回归方程、线性范围和检出限，见表3。

表2 38 种多酚化合物在CID 裂解模式下产生的碎片离子（碰撞能量为35%）Table 2 Product ions of the 38 polyphenols in CID modes （collision energy 35%）

表3 38 种多酚化合物的线性回归方程、相关系数、线性范围和检出限Table 3 Calibration curves （y ＝ax＋b），correlation coefficients （R2），linear ranges，limits of detection （LODs）of the 38 polyphenols

表3 （续）Table 3 （Continued）

样品采用直接加标测试回收率，采用1、3、10 倍定量限（线性范围的最低点）进行分析，每个添加水平平行测定6 次，回收率在90% ～102% 之间，相对标准偏差（RSD）在0.51% ～2.56% 之间（见表4），完全满足实验分析要求。

表4 空白样品中3 个加标水平的38 种多酚化合物的回收率范围及相对标准偏差Table 4 Recovery ranges and RSDs of the 38 polyphenols at three spiked levels

表4 （续）Table 4 （Continued）

2.4 实际样品的检测

对葡萄酒中的多酚化合物进行检测，高分辨质谱能够避免其他方法中干扰杂质存在的不足，大大降低假阳性的出现率。以本研究建立的方法对进口及国产的28 个葡萄酒样品进行了分析测定，大部分葡萄酒含有17 种多酚化合物（没食子酸、原儿茶酸、原花青素B1、绿原酸、儿茶素、对羟基苯甲酸、龙胆酸、原花青素B2、咖啡酸、表儿茶素、金丝桃苷、对香豆酸、杨梅素、木樨草素、槲皮素、白藜芦醇、山柰酚），另外21 种多酚化合物未检出。有两个葡萄酒样品未检出任何多酚化合物，疑是假冒葡萄酒，经检查含有非法色素，确是假冒产品。