EPO联合BMSCs治疗对大鼠脊髓损伤修复的影响

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(南华大学附属第一医院脊柱外科，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

EPO联合BMSCs治疗对大鼠脊髓损伤修复的影响

谢中，羊明智*，胡文凯，彭立军，刘骞

(南华大学附属第一医院脊柱外科，湖南 衡阳 421001)

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)与促红细胞生成素(EPO)联合应用对大鼠脊髓损伤修复的影响。方法将80只SD大鼠随机分成手术对照组(n=15)、EPO治疗组(n=15)、BMSCs治疗组(n=25)和BMSCs联合EPO治疗组(简称联合组、n=25)。造模后第7天EPO组大鼠经腹腔注射EPO,BMSCs组、联合组大鼠则经损伤脊髓局部注射BMSCs和局部注射BMSCs的同时加用EPO腹腔注射。应用双标免疫荧光法检测5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的神经元中丝蛋白(NF-M)的表达情况；取脊髓组织作HE染色观察脊髓损伤及恢复程度；用(BBB)法检测大鼠神经功能的恢复情况。结果联合组较BMSCs移植治疗组炎性细胞浸润和组织水肿显著减轻。移植的BMSCs在宿主脊髓中存活，联合组中NF-M阳性细胞数目均比其余组多(P<0.05)。联合组在不同的时间点神经功能BBB评分都较BMSCs组及EPO组高。结论BMSCs移植与EPO腹腔注射是治疗大鼠脊髓损伤的有效方法；BMSCs与EPO联合应用对脊髓损伤修复具有协同作用。

促红细胞生成素； 间质干细胞； 脊髓损伤； 移植； BBB评分； 神经功能恢复

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是中枢神经系统的一类严重创伤，其高致残率和死亡率成为脊柱外科工作者急需解决的难题。近年来随着神经生物学的飞速发展，细胞移植成为治疗脊髓损伤最有希望的方法之一[1]。从目前的资料来看，BMSCs(Bone mesenchymal stem cell，BMSCs)具有多向分化潜能[2]、极大的可塑性[3]、强大的增殖能力[4]、高度的迁移性等特点[5]成为理想的细胞移植治疗和基因治疗的首选细胞。促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种多功能神经营养因子和保护因子，具有调节中枢神经系统发育、营养神经和保护神经的作用，是一个新的具有广阔发展前景的神经保护剂[6]。本实验通过对Allen’s大鼠脊髓损伤模型局部进行BMSCs移植的同时加用EPO腹腔注射，研究局部移植BMSCs在脊髓损伤修复中的作用，并探讨EPO与BMSCs联合应用对大鼠脊髓损伤修复的影响以及EPO在大鼠体内是否可以诱导BMSCs向神经细胞分化，为治疗脊髓损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1动物、试剂及仪器80只健康SD青年大鼠，清洁级，体重220±10 g，均购于湖南省人民医院中心实验室。重组促红细胞生成素，2000 IU/支，由沈阳三生制药有限责任公司生产(批号：1001032)。DAB显色剂(武汉博士德生物有限公司)，BrdU(广州市锐博生物有限公司)，鼠抗神经元中丝蛋白单抗(美国Neomaekers公司)，小鼠抗BrdU抗体(武汉博士德生物有限公司),苏木素伊红染液(重庆东方制药厂),YPS-2000系列彩色病理图文分析(德国莱卡公司),ZMN-6802病理组织溶烘仪(常州市华利电子公司),LeicaRM2016切片机(上海来卡仪器),YB-6D生物组织石蜡包买机(湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司)。

1.2分组及给药方法80只SD大鼠随机分为4组：对照组、EPO治疗组、BMSCs治疗组、BMSCs联合EPO治疗组。对照组大鼠于造模后第7天在损伤脊髓局部注射5 μL BMSCs培养液；EPO治疗组于造模后第7天按2 000 lU/kg腹腔注射EPO进行治疗；BMSCs治疗组于造模后第7天在损伤脊髓局部注射5 μL BMSCs悬液进行治疗；BMSCs联合EPO治疗组(简称联合组)于造模后第7天在损伤脊髓局部注入5 μL BMSCs悬液，同时按2 000 lU/kg腹腔注射EPO治疗。对照组、EPO组各15只大鼠，BMSCs组、联合组各25只。

1.3 BMSCs的移植[7]大鼠脊髓损伤模型建立后第7天，把培养液加入5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记过的第3代BMSCs(由中南大学国家重点遗传学实验室提供)，将细胞浓度调至5×104～1×105个/μL的范围内待用。用微量注射器将5 μL经BrdU标记的BMSCs细胞悬液缓慢注入BMSCs组及联合组大鼠损伤脊髓临近区域的灰白质交界处。

1.4行为学检测移植治疗后1天,7天，14天，21天，28天，各组取10只大鼠置于宽阔的地板上，在双盲法的前提下观察其双侧后肢各关节运动的范围和数量，根据双下肢步态是否协调以及运动程度进行运动功能评分(BBB)[8]，并作记录，对所得数据进行重复测量的方差分析。

1.5动物取材及阳性细胞的判定和计数对照组、EPO组21天时随机选5只大鼠取标本做常规HE染色及神经元中丝蛋白(neurofilament-M,NF-M)免疫组化，光镜下观察组织病理学的变化。BMSCs组及联合组3天、7天、21天时随机选5只大鼠取标本行Brdu+NF-M双标免疫荧光，另取21天时标本做常规HE染色及NF-M免疫组化。在400倍光镜下，随机计数相应时间点5个视野中Brdu和NF-M双染，NF-M单染阳性细胞，取其平均值。

2 结 果

2.1大鼠脊髓损伤行为学检测(BBB评分) 治疗后第7天、14天、21天和28天时，EPO组、BMSCs组及联合组的BBB评分比对照组明显升高，且联合组的神经功能改善明显高于EPO组和BMSCs组，见表1。

表1各组大鼠各个时间点BBB评分表(分)

组别第1天第7天第14天第21天第28天对照组3.05±0.124.57±0.236.68±0.288.12±0.3610.12±0.35EPO组3.35±0.146.45±0.28ab8.67±0.34ab12.42±0.52ab14.83±0.54abBMSCs组3.38±0.246.56±0.32ab8.92±0.24ab13.16±0.44ab15.14±0.67ab联合组3.56±0.199.14±0.38a12.16±0.43a15.71±0.65a17.68±0.86a

与对照组比较，a:P﹤0.05；与联合组比较，b：P<0.05

2.2脊髓组织HE染色检查结果移植后21天，手术对照组(图1A)有较多空腔，白质中有许多微囊，神经纤维及细胞坏死，在挫伤处附近形成较多空泡；联合组(图1B)脊髓组织在高倍镜下观察可见脊髓组织中无明显空腔，空泡小而少，色泽较亮，胶质细胞增生活跃，脊髓有许多增生组织填充，损伤脊髓周围能见到较完整的神经细胞；EPO组(图1C)和BMSCs组(图1D)神经纤维及细胞变性、坏死的程度和数量较重。

图1 治疗后第21天各组大鼠脊髓组织恢复情况(HE染色×200) A：对照组；B：EPO组；C：BMSCs组；D：联合治疗组

2.3 Brdu与NF-M双标免疫荧光染色结果联合组(图2A)与BMSCs组(图2B)脊髓组织内均可见到BrdU标记的阳性细胞存在，联合组中BrdU标记的阳性细胞数目比BMSCs组多；从移植后的第7天可以检测到BrdU和NF-M双标染色阳性的细胞。联合组(图2C)中BrdU和NF-M双标染色阳性的细胞数较BMSCs组(图2D)多(P<0.05)。

图2 BrdU和NF-M双标染色阳性的细胞分布(免疫荧光×400) A：联合治疗组治疗第3天；B：BMSCs组治疗第3天；C：联合治疗组治疗第7天；D：BMSCs组治疗第7天

2.4 NF-M免疫组化结果对照组(图3A)可见少量免疫反应阳性的神经纤维，较小，也可见少量胶质细胞活跃增生，突起细而短；EPO组(图3B)与BMSCs组(图3D)可见较多的染色阳性的神经纤维，少量长入瘢痕内，胶质细胞增生较对照组多；而EPO加BMSCs联合应用组(图3D)可见大量染色阳性的神经纤维，较多的长入瘢痕内，星形细胞出现明显的功能活跃，肥大，突起增多。治疗组阳性细胞数目较对照组明显增多；联合组阳性细胞数目比EPO组、BMSCs组明显增多(P<0.05)。

图3 各组治疗后21天NF-M表达情况(DAB×400) A：对照组；B：EPO组；C：BMSCs组；D：联合治疗组

3 讨 论

研究表明BMSCs移植能有效促进损伤脊髓功能的恢复[9-10]。BMSCs保护神经的作用机制可能是:(1)BMSCs可以分泌NGF等神经营养因子，促进神经递质的生成和轴突生长，对受损的神经细胞起保护作用与修复作用[8]；(2)移植的BMSCs可作为轴突再生的支架，引导轴突向前生长，抑制瘫痕形成，建立新的突触联系，重建神经通路；(3)BMSc可以促进新生血管的生成与血管重建，改善受损神经的血供，为受损神经提供营养[8];(4)免疫调控作用:BMSc可以通过自身免疫过程，阻止免疫损伤，对神经起保护功能[11]；(5)BMSc减轻细胞凋亡水平，激活休眠状态的神经细胞，促进神经恢复[12]。

传统认识中，EPO被认为是一种促进红细胞增殖，纠正贫血的内分泌激素。近来EPO已被实验证实是一种新型的神经保护剂[13]。EPO通过与促红细胞生成素受体结合而发挥其神经保护作用，其作用机制有以下几点：(1)EPO在早期可以维持损伤脊髓的血供，并可以促进局部血管的生成，提高损伤脊髓对缺血、缺氧的耐受性[14]；(2)EPO可以通过减少神经细胞的凋亡，减少神经功能缺失，并能抑制局部的炎症反应，为脊髓的恢复创造有利的局部内环境[15]；(3)EPO是一种神经营养因子，可以促进神经系统的发育，增加神经元的生成[16]。研究表明NF-M在神经细胞的氧化应激后表达发生明显的改变，可通过稳定细胞骨架和抑制轴突回缩而促进轴突延长，起到促进神经功能恢复的作用[17]。

本实验中治疗后第21天,对照组较多空腔，神经纤维及细胞变性坏死。联合组脊髓组织脊髓组织中无明显空腔，脊髓有许多增生组织填充，损伤脊髓周围能见到较完整的神经细胞；联合组可见更多的NF-M阳性细胞，明显多于EPO、BMSCs单独治疗组。再结合各组的BBB评分与组织学观察可见联合组神经损伤凋亡明显减轻，神经轴突再生显著增多，神经功能明显好转；机制可能为EPO与BMSCs表达的EPO受体结合后动员BMSCs进入损伤区;此外，EPO为移植的BMSCs创造有利于生存的局部内环境，促进BMSCs分化为神经元细胞，替代死亡的神经细胞，分泌大量的NF-M稳定细胞骨架，促进轴突再生、再通，促进神经功能恢复。EPO调节局部血管，维持供血及供氧，两者共用具有协调作用。

总之，脊髓损伤的再生修复是一个多因素参与的复杂过程，是一个世界性的难题。原因之一是因为缺乏合适的微环境，限制了损伤神经轴突的再生。EPO能改善损伤局部的微环境，抑制细胞凋亡，有利于移植的BMSCs在体内存活、分化增加，促进神经系统的发育。EPO与BMSCs联合移植后，增加了存活细胞及分化为神经元细胞的数量，替代变形凋亡的神经元细胞，促进轴突的再生与再通，促进神经功能的恢复。EPO与BMSCs联合治疗具有协同效应。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.006

2015-01-29；

2015-05-02

*通讯作者，E-mail:Mingzhiyang@126.com

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(此文编辑：蒋湘莲)