利用酶解-发酵联用技术提高猪骨泥的功能性*

王帅楠，宗红，陆信曜，诸葛斌，方慧英，党艺文，孙进，楼笑笑，冯倩

1(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院，工业微生物研究室，江苏无锡，214122)

3(浙江正味食品有限公司，浙江省调味食品制造工程技术研究中心，浙江义乌，322000)

畜禽鲜骨大约占到胴体的10% ～15%，是肉类加工业中一个非常重要的副产物，随着我国畜禽养殖业的迅猛发展，畜禽肉类产量逐年递增，其副产物畜禽骨骼的产量也随之迅速增加，每年有近约2 000万t的畜禽骨头产生。畜禽骨骼除富含蛋白质、脂肪、骨胶原、软骨素(酸性黏多糖)等营养成分外，还含有多种矿物质，如锌、磷、钙、铁等，含量是鲜肉的数倍，营养极为丰富。

目前，对畜禽骨的加工利用已受到重视。丁小燕［1］等人利用复合风味蛋白酶对鸡骨进行深度水解，确定了蛋白酶酶解工艺，获得含有丰富氨基酸的动物水解蛋白。Quaglia［2］等人研究表明，采用酶解等方法能够有效地将骨蛋白与不可溶性残留成分分开，并获得具有一定功能特性的短肽。秦斌钰［3］等人利用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌对猪骨泥进行发酵，使骨蛋白水解度提高到46.1%。利用单一的商品蛋白酶或菌株发酵水解骨蛋白深度有限，回收利用率不高，骨原料得不到充分利用。

本研究将酶解与发酵技术联用对猪骨中的骨蛋白进行水解处理，为考察该技术对猪骨泥功能性品质的影响，对其可溶性胶原蛋白、可吸收性钙、小肽、功能性氨基酸、抗氧化活性等进行分析，为畜禽骨类的功能性开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)F2，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)M1，江南大学微生物研究中心保藏。

1.1.2 原料与仪器

新购新鲜畜骨粗粉经高压蒸煮、烘干、粉碎备用。DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、4-二甲氨基苯甲醛、羟脯氨酸标准品、异硫氰酸苯酯为sigma公司产;蛋白酶protexTMP购于Genencor;其他试剂为分析纯。

MP5002电子天平，上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂;alltech高效液相色谱仪，美国alltech公司;立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司;多功能高速粉碎机，上海广沙工贸有限公司;超净工作台，苏州空气净化设备厂。

1.1.3 培养基

菌株活化培养基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0;种子培养基(g/L):骨粉 15.0，NaCl 5.0;发酵培养基(g/L):骨粉200.0。

1.2 实验方法

1.2.1 猪骨泥加工工艺

酶解:蛋白酶protexTMP在65℃，pH9.0，加酶量为6 000 U/g条件下酶解7 h后，于100℃水浴中加热3～5 min，酶解液离心后取上清液备用。

发酵:Bacillus subtilis F2和L.plantarum M1种子液按菌株比1.3∶1，以3%接种量接种，37℃，150 r/min的条件下分别发酵36 h。发酵液离心后取上清液备用。

酶解-发酵:猪骨泥进行酶解后，以Bacillus subtilis F2和L.plantarum M1种子液按菌株比2∶1，接种量3%接种，37℃，150 r/min的条件下分别发酵30 h。发酵液离心后取上清液备用。

1.2.2 总氮的测定

采用凯氏定氮法［4］。

1.2.3 小肽含量的测定

采用 TCA 沉淀法［5］。

1.2.4 水解度的测定

采用甲醛滴定法［6］。

1.2.5 氨基酸的测定［7］

1.2.6 羟脯氨酸的测定［8］

1.2.7 发酵液抗氧化性测定

(1)清除DPPH自由基能力的测定

取1.5 mL发酵上清液加入1.5 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)混合均匀，室温避光反应30 min，517 nm下测定吸光值Ai，空白组以等体积95%乙醇代替DPPH溶液，记作Aj;对照组以等体积去离子水代替样品记作Ao。DPPH自由基清除率:

DPPH(%)=［1-(Ai-Aj)/Ao］。

(2)清除羟自由基(·OH)［9］能力、清除超氧自由基(O2-·)［10］能力测定及还原力测定［11］

1.2.8 酶解产物多肽分子量分布

采用高效液相色谱法。色谱条件:色谱柱:TSK-gel2000 SWXL(300 mm×7.8 mm);流动相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;紫外检测波长:220 nm;流速:0.5 mL/min;柱温:30℃;进样量:10 μL。

1.3 数据分析

本实验所有数据测定均重复3次，所获结果进行单因素方差分析。采用Duncan新复极差法分析95%的置信区间内不同处理间显著性差异，所用软件为 SPSS 19.0(SPSS Inc，Chicago，Illinois，USA)。

2 结果与讨论

2.1 酶解-发酵处理猪骨泥可溶性胶原蛋白及可溶性钙含量分析

胶原蛋白是一类具有独特结构的功能性蛋白，而羟脯氨酸是其主要成分之一，在正常胶原蛋白中占13.4%［12］。由于猪骨中富含胶原蛋白，水解后骨泥中的羟脯氨酸(Hyp)含量在一定程度上可以反映其可溶性胶原蛋白的含量。不同处理后猪骨泥羟脯氨酸及可吸收性钙含量如图1所示。

图1 不同处理下样品中Hyp及可溶性钙含量Fig.1 The contents of soluble hydroxyproline and soluable calciumin different samples

由图1可知，与酶解样品相比，酶解-发酵处理样品中Hyp及可吸收性钙含量分别提高了68.16%和112.79%;与菌株发酵处理样品相比分别提高了95.38%和44.09%。表明酶解-发酵联用技术对产品中可溶性胶原蛋白及可吸收性钙含量有着显著性影响(P＜0.05)。利用安全菌株乳酸菌分泌有机酸溶出骨泥中以羟基磷灰石结构存在的钙，变成利于人体消化吸收的可吸收性钙，同时骨泥结构疏松多孔，表面积增加，使得未被蛋白酶酶解的骨蛋白在发酵菌株作用下分解为可溶性胶原蛋白及小肽、氨基酸。

2.2 酶解-发酵处理猪骨泥氨基酸含量分析

利用高效液相色谱对不同处理样品中的氨基酸进行分析，结果如表1。由表1可知，与酶解处理样品相比，酶解-发酵处理样品中必需氨基酸、抗氧化性氨基酸、鲜味氨基酸含量分别提高了65.84%、141.9%和112.25%;与菌株发酵处理样品相比分别提高了37.44%、109.21%和48.18%。可见，酶解-发酵处理提高了样品中的必需氨基酸、鲜味氨基酸、抗氧化性氨基酸含量，在丰富产品风味的同时又提高产品的营养保健功能特性。

表1 不同处理样品的氨基酸含量Table 1 Amino acids composition of different hydrolysates

2.3 酶解-发酵处理猪骨泥小肽含量及蛋白水解物分子量分布

猪骨蛋白水解产物中多肽的分子质量大小及分布是决定其功能性重要因素之一，不仅反映蛋白的水解程度，而且与水解物的抗氧化特性有着密切联系［13］。

由图2可见，3种加工工艺在其最佳处理条件下，酶解-发酵处理样品水解度(DH)、小肽含量均高于另两种处理，分别为61.26%、19.16 mg/mL。由表2可知，猪骨蛋白经酶解-发酵处理后，酶解-发酵技术对分子质量大于5 kDa多肽含量无显著性影响(P＞0.05)，但对分子质量小于1 000 Da的小肽所占的比例有显著提高(P＜0.05)，占54.38%。生物活性肽常含有2～20个氨基酸且分子质量越小能够被肠道吸收呈现生物活性功能的可能性越大［14］。由此可见，酶解-发酵处理技术提升了产物的功能特性。

图2 不同处理下样品骨蛋白水解度和小肽含量Fig.2 The DH and the content of peptides in different samples

表2 骨蛋白水解后分子质量分布及其所占比例Table 2 The molecular mass distribution and proportion of peptides of different samples

注:表中数据为3次重复的平均值±标准差。小写字母表示P≤0.05，不同字母表示差异显著(Duncan新复极差法分析)。

2.4 酶解-发酵处理猪骨泥抗氧化活性分析

清除DPPH自由基、超氧阴离子(O2-·)、羟基自由基(·OH)的能力和对铁的还原能力是衡量物质抗氧化活性的常用关键指标。对不同发酵样品进行抗氧化活性的测定，结果见图3。

由图3可以看出，酶解-发酵处理对猪骨泥抗氧化活性有着显著性影响(P＜0.05)。与酶解样品相比，酶解-发酵处理样品的清除O2-·的能力、清除·OH的能力和对铁的还原能力分别提高了约45.32%、73.23%、164.23%，发酵处理样品的抗氧化活性略高于酶解处理样品。酶解-发酵处理后的猪骨泥小分子短肽比例大大提高，含有更多可以作为电子供体的底物，能够与自由基结合转化为状态比较稳定的物质终止自由活性链反应［15］，使得其抗氧化活性得以提高。

图3 不同发酵时间样品的抗氧化活性的分析Fig.3 Analysis of antioxidant capacity in different samples

3 结论

研究发现，与商品酶酶解样品相比，酶解-发酵技术处理样品对可溶性胶原蛋白、可吸收性钙、小肽含量有显著提高，可溶性胶原蛋白中羟脯氨酸及可吸收性钙含量分别提高了95.38%和112.79以上;必需氨基酸含量提高了2倍以上，鲜味氨基酸、抗氧化氨基酸分别提高了112%和142%。酶解-发酵处理样品产物中分子质量小于1 000 Da的小肽所占的比例为54.38%，提高了78.73%，抗氧化活性提高了45.32% ～164.23%。结果表明，酶解-发酵技术不仅提高了猪骨泥原料的利用率，还增强了其营养保健功能，为开发高品质且具有营养保健功能的猪骨基原料品提供了依据。

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