碳、氮和磷对松乳菇生长及矿质营养的影响*

苏菲娅，辜夕容，邓雪梅，刘颖旎，曾清苹，刘妍君，赵天琪

(西南大学 资源环境学院，重庆，400716)

松乳菇(Lactarius deliciosus(L.ex Fr.)Gray)，红菇科乳菇属，湘西称乌松菌，又名美味松乳菇、松树蘑、松菌、雁来菌，是在南北美洲、欧洲、亚洲、非洲［1］，以及中国的四川、重庆、贵州、云南、广西、江苏、浙江、湖南、湖北、河北、辽宁、吉林、青海、台湾等地广泛分布的一种野生食用菌类。它是一种外生菌根型食用真菌，子实体单生或丛生，常与松属树种如马尾松(Pinus massoniana)、海岸松(P.pinaster)［2］、黑松(P.nigra)、樟子松(P.sylvestris)［3］等共生，自然分布于海拔200～1 500 m的温暖湿润、腐殖质丰富地带。松乳菇味美细嫩，营养丰富，富含谷氨酸、天冬氨酸等多种氨基酸和维生素，以及P、Ca、Mg、Zn等矿物质［4］。近年来更发现其提取物富含生物活性物质如真菌多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、色素类化合物、甾醇、倍半萜烯等［1，5］，以及淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、酪氨酸酶、漆酶等酶类并具有褪去多种合成色素的功能［6］，对肉瘤-180和艾氏腹水癌有抑制作用［7］，是宜膳宜药的山林之珍［8］，深受消费者喜爱，并极具开发利用价值。

目前，松乳菇主要来源于人工野外采集，远远满足不了市场需求。研究者们开始探索松乳菇的人工栽培技术或液体发酵技术，以缓解这种供需矛盾。周传云［8］、周国英［9］等采取新鲜野生松乳菇子实体进行菌种分离和纯化，并初步了解了其培养特性;李静［10］、林亲雄［11］、廖晓初［12］、龙芳［4］等分别探索了氮源、碳源和氮源、氮源、生长调节物质对松乳菇菌丝生长的影响，以确定适宜松乳菇菌丝生长的最佳培养基组成。并且周传云［8］、李文艺［13］、吴连旺［14］等还利用松木屑、松针浸出液等材料制作栽培种，以进行人工栽培，但均未获得子实体。Parlade等［2］利用松乳菇是外生菌根型食用真菌的特性，将其接种于海岸松林下而获得子实体，Guerin-Laguette等［15］也将松乳菇接种于辐射松(Pinus radiata)而获得子实体，他们都实现了松乳菇的仿生栽培。李倩茹［16］、李磊［17］直接对松乳菇进行发酵培养以提取有效成分或制作成饮料。无论是发酵培养或是仿生栽培，都离不开松乳菇菌丝体的培养。在前人探索培养基组成中，研究最多的碳源、氮源，且主要考虑了它们对菌丝体生长的影响，而对其矿质营养或其他功能成分的吸收和积累则少有探索。P是合成菌体细胞和一些功能性物质必不可少的原料［18］，但目前关于P对松乳菇生长的影响还少有报道。鉴于此，试验在成功分离纯化松乳菇的基础上，设置了碳源、氮源、磷量的三因素三水平正交试验，以探索三者对松乳菇菌丝体生长和矿质营养的影响，寻找能促进松乳菇生长和矿质营养积累的优化培养基。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验选用采自重庆市缙云山国家级自然保护区的马尾松林下，经分离纯化并鉴定的松乳菇Ld3为供试菌株，该菌在Pachlewski固体培养基上的菌丝分泌物为紫红色。取保存菌株接种于Pachlewski固体培养基，(25±1)℃培养21 d备用。固体培养基组成为:葡萄糖20 g/L、酒石酸铵0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、M 一 SO40.5 g/L、VB10.1 g/L、微量元素 1 mL/L(H3BO38.45 mg、M 民 SO45 mg、F 有 SO46 mg、C 产SO40.625 mg、ZnSO4/ZnCl22.77 mg、(NH4)2Mo4O130.27 mg)，琼脂 20 g/L，pH值 5.8。无琼脂时为Pachlewski液体培养基。

1.2 试验设计

以Pachlewski为基本培养基，选用L9(34)正交表，按表1设置碳源、氮源和磷量三因素三水平试验。在前期单因子筛选试验基础上，所选碳源及其用量分别为:葡萄糖20.0 g/L、可溶性淀粉18.0 g/L、蔗糖19.9 g/L，使培养基中碳含量均为8.0 g/L;所选氮源及其用量分别为:酒石酸铵0.5 g/L、尿素0.16 g/L、谷氨酸0.8 g/L，使培养基中氮含量均为0.08 g/L。所用磷由磷酸二氢钾提供，用量分别为0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L。以Pachlewski液体培养基中的碳源、氮源及磷量为对照。

表1 正交试验设计的因素和水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design

将上述因素及水平按L9(34)正交表配制成9种液体培养基，分装于150 mL三角瓶中(20 mL/瓶)，封口膜封口后于121℃高温高压蒸汽灭菌20 min，冷却至室温。于超净工作台上分别接种直径约4 mm的供试琼脂菌种1块。(25±1)℃ 黑暗条件下静置培养21 d。试验作3次，每处理设5次重复，取平均值。

以上所用试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

LDZX-50KB高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂;JJ-CJ-2F超净工作台，吴江市净化设备总厂;RXZ-310B培养箱，宁波东南仪器有限公司;202-2A烘箱，天津市泰斯特仪器有限公司;FA2004天平，上海越平科学仪器有限公司;W-5200可见分光光度计，上海元析仪器有限公司;FP6410火焰光度计，上海欣意仪器有限公司;TAS-990 AFG原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.4 测定项目与方法

培养结束后，过滤收集菌丝，去离子水洗净，(80±1)℃ 烘至恒重，称重(精确到0.000 1 g)。然后用HNO3-HClO4法消化菌丝，分别用钼锑抗比色法测磷，火焰光度计法测钾，原子吸收分光光度法测钙、镁、铁、锌和锰的含量［19］。

1.5 数据处理与分析

试验数据用SPSS 19.0统计软件作方差分析，SSR法作数据间的多重比较，Pearson法作相关分析。显著水平设置为0.05。用Microsoft Excel 2010制作图表。

2 结果与分析

2.1 松乳菇菌丝体的生物量、矿质养分含量及差异分析

松乳菇Ld 3在培养21 d后菌丝体的生物量(干重)及矿质养分含量见表2。所测定的8个项目中，除锰含量的变异系数稍小，仅为9.84%外，其他指标的变异幅度均超过10%，由大到小依次为:K(54.10%)＞Ca(37.18%)＞Zn(30.57%)＞P(20.31%)≥生物量 (20.10%)＞Fe(13.93%)＞Mg(12.68%)＞Mn(9.84%)。可见，由碳源、氮源、磷量三因素三水平组成的9种培养基对松乳菇菌丝体的生物量及矿质养分含量均有明显影响，可用上述8个指标对培养基进行筛选和优化。

表2 松乳菇菌丝体的生物量、矿质养分含量及差异分析Table 2 Variations of biomass and mineral nutrition content in mycelium of Lactarius deliciosus

2.2 碳源、氮源、磷量对松乳菇菌丝体生长和矿质营养的影响

2.2.1 碳源对松乳菇菌丝体生长和矿质营养的影响

表3可见，碳源不同，松乳菇菌丝体的生长和P、K、Zn 含量差异显著，但 Ca、Mg、Fe、Mn 含量却无明显差异。3种碳源中，效果最好的是可溶性淀粉，其次是蔗糖，最差的是葡萄糖。和培养菌根真菌常用的碳源葡萄糖相比，可溶性淀粉可令松乳菇生物量增加32.20%，P、K、Zn含量分别增加 16.94%、182.81%、59.09%，说明可溶性淀粉比葡萄糖更适于松乳菇菌丝体的生长和P、K、Zn的吸收。

表3 碳源对松乳菇菌丝体生长和矿质养分含量的影响Table 3 Effect of carbon sources on the biomass and mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.2.2 氮源对松乳菇菌丝体生长和矿质营养的影响

氮源不同，培养出的松乳菇菌丝体生物量与P、K、Mg、Fe、Mn含量差异明显，Ca和 Zn含量未受明显影响(表4)。3种氮源中，酒石酸铵最利于菌丝体生物量积累，尿素最利于菌丝体对磷和钾的吸收，谷氨酸最有利于菌丝体对Mg、Fe、Mn的吸收。与谷氨酸相比，酒石酸铵可使松乳菇生物量增加27.29%，尿素可令松乳菇菌丝体的P、K含量分别增加7.74%、34.26%;与酒石酸铵相比，谷氨酸可令菌丝体的Mg、Fe、Mn含量分别增加17.95%、26.75%、20.18%。

表4 氮源对松乳菇菌丝体生长和矿质养分含量的影响Table 4 Effect of nitrogen sources on the biomass and mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.2.3 磷量对松乳菇菌丝体生长和矿质营养的影响

表5可见，培养基中KH2PO4量的多寡显著影响松乳菇的生物量积累和 P、K、Mg、Mn、Zn的吸收，但对菌丝体Ca和Fe的吸收无明显作用。P量的三水平中，以0.5 g/L最适于松乳菇菌丝体的生长和对P、K、Mg、Zn的吸收。与常用量1.0 g/L相比，0.5 g/L KH2PO4可令松乳菇菌丝体生物量增加8.42%，P、K、Mg、Zn含量分别增加 42.89%、31.97%、20.85%、54.52%。2.0 g/L KH2PO4仅在对Mg的吸收上显著优于另2种P水平。

表5 磷量对松乳菇菌丝体生长和矿质养分含量的影响Table 5 Effect of phosphorus dosage on the biomass and mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.2.4 碳氮比、碳磷比、氮磷比与松乳菇菌丝体生长和矿质营养的关系

根据培养基的组成及含量，计算出C/N比、C/P比及N/P比，并获得它们与松乳菇菌丝体生物量和矿质养分含量间的相关系数(表6)。可以看出，C/N比除与生物量有较显著的负相关关系(P=0.093)外，与矿质养分含量间无明显相关;而C/P比、N/P比则只与P含量、Zn含量有显著正相关，与生物量及其他矿质养分含量间关系均不显著。由此表明，在试验给定范围内，培养基中的C/N比增加不利于松乳菇的生长，而C/P比和N/P比增加有利于菌丝体对P和Zn的吸收。

表6 碳氮比、碳磷比、氮磷比与松乳菇菌丝体生长和矿质养分含量间的相关性Table 6 Pearson correlations between C/N，C/P，N/P and biomass，mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.3 培养基优化

从各指标在碳源、氮源和磷量各水平间的极差(表7)可看出，松乳菇的生物量、K含量、Ca含量受碳源影响最大，Fe和Mn含量受氮源影响最大，P、Mg和Zn含量受磷量影响最大。结合多重比较结果(表3、表4、表5)可以得出，有利于松乳菇生长的最佳组合是A2B1C3(可溶性淀粉 +酒石酸铵 +0.5 g/L KH2PO4)，有利于菌丝体吸收 P、K、Ca、Zn的最佳组合是 A2B2C3(可溶性淀粉 +尿素 +0.5 g/L KH2PO4)，有利于菌丝体吸收镁、铁的最佳组合是A2B3C3(可溶性淀粉+谷氨酸+0.5 g/L KH2PO4)，有利于菌丝体吸收锰的最佳组合是A2B3C3(可溶性淀粉+谷氨酸+2.0 g/L KH2PO4)。综合考虑菌丝体的生长、矿质营养的积累以及培养成本，A2B1C3(可溶性淀粉+酒石酸铵+0.5 g/L KH2PO4)应是松乳菇菌丝体培养的最优组合。

表7 正交试验结果的极差分析Table 7 Range analysis on data from orthogonal experiments on cultivation of Lactarius deliciosus

3 讨论与结论

碳是构成食用菌细胞和代谢产物中碳架来源的营养物质，也是食用菌生命活动所需要的能源。在松乳菇菌丝培养过程中，使用较多的碳源有葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、半乳糖、木糖、麦芽糖、乳糖、糊精、淀粉、玉米粉等［9，11，20-21］，被认为合适的碳源有葡萄糖［14］、麦芽糖［20-21］、蔗糖［9］、可溶性淀粉［11］等。试验发现可溶性淀粉为最佳碳源，其促生效果优于葡萄糖32.20%，与林亲雄等［11］得到的最适碳源为可溶性淀粉较一致，而与吴连旺等［14］认为葡萄糖是最佳碳源的结果差异较大。这可能与所使用的碳源有关。当无可溶性淀粉时，其他单糖或二糖被认为是最佳碳源，而有可溶性淀粉时，葡萄糖或蔗糖则稍次。另外，菌株不同，适用碳源也有差异。本试验用的是松乳菇Ld 3，吴连旺等［14］在作最优碳源试验时，使用的菌株是Ld 1，这也可能导致了最终结果的不同。Ld 3在可溶性淀粉为碳源时的生长和矿质元素含量均优于葡萄糖和蔗糖，即该菌株利用多元糖的效果好于单糖和二糖，说明其分泌胞外酶如淀粉酶的能力较强，这也可能是Khaund等［6］认为可利用松乳菇生产淀粉酶的原因之一。

松乳菇能利用的氮源较多，主要有蛋白胨、硝酸钾、乙酸铵、硫酸铵、酒石酸铵、甘氨酸等。对于哪种氮源更适于松乳菇生长，分歧较大。如廖晓初等［12］认为硝态氮比铵态氮合适，但周国英等［9］却认为铵态氮优于硝态氮;林亲雄等［11］则认为蛋白胨和KNO3都是最佳氮源，但周传云等［8］却认为蛋白胨是最好氮源，硝酸钾次之，吴连旺等［14］发现KNO3为氮源的菌丝长势不好。试验发现，最适于松乳菇生长的是酒石酸铵，同时尿素和谷氨酸都适于松乳菇生长，只是效果稍差。在矿质养分吸收方面，3种氮源各有所长:谷氨酸对镁、铁、锰，尿素对磷、钾上都优于另2种氮源。至于何种氮源更合适，应与所用菌株或培养基有关，而且矿质营养或其他活性物质的积累可能对氮源的要求也不尽相同，这还需要进一步研究。

磷在食用菌生长过程中能很快被吸收，在细胞内用于核酸磷脂和核苷酸的合成。试验发现，供给少量磷(0.5 g/L)时，松乳菇的生长和对 P、K、Mg、Zn 的吸收都最佳，而且C/P比、C/N比越高，菌丝体的磷含量也越高，结果与薛小平等［22］得到的结果较一致。松乳菇是一种外生菌根型食用真菌，自然生长于酸性缺磷土壤［23］，长期的适应可能使某些株系能溶解难溶性磷供自身利用［18］，这也可能正是松乳菇在少磷水平下生长更好的原因之一。

按L9(34)正交表设计的9种培养基组合对松乳菇生长和矿质营养吸收均有明显影响。三因素对8个指标的影响重要性各不相同:碳源主要影响菌丝体生长和K、Ca的吸收，氮源主要影响Fe、Mg的吸收，P量主要影响P、Mg、Zn的吸收。在碳源的三水平中，效果最好的是可溶性淀粉，其次是蔗糖，最差的是葡萄糖;在氮源的三水平中，对生长最有利的是酒石酸铵，对P、K吸收最有利的是尿素，对Mg、Fe、Mn吸收最有利的是谷氨酸;在磷量的三水平中，0.5 g/L KH2PO4最适于菌丝体生长和对P、K、Mg、Zn的吸收。最适于松乳菇菌丝体生长和矿质营养吸收的优化培养基组合是:可溶性淀粉 +酒石酸铵 +0.5 g/L KH2PO4。

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