降解蓖麻饼粕毒素的SJM酵母培养基优化

帅娜娜， 王昌禄， 陈勉华， 王玉荣， 徐小洲， 王文杰， 叶 峰

（1.庆阳市农业科学研究院，甘肃庆阳745000；2.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津河西300457；3.天津市畜牧兽医研究所，天津市农科院饲料工程技术研究中心，天津西青 300112；4.南开大学蓖麻工程中心，天津南开 300071）

有研究表明，自然界中有许多微生物可以降解或转化有毒物质 （Dubey和Holmes，1995）。 利用生物法脱毒不但能除去蓖麻饼粕中的蓖麻碱和变应原，还可以提高蓖麻饼粕的粗蛋白质含量（Pandey等，1999）。但目前研究内容大多集中在菌种选育、发酵参数优化以及发酵后蓖麻饼粕营养成分含量测定等方面，因此有必要开展对含有蓖麻饼粕的发酵培养基进行优化研究，使生物法的脱毒效果得到进一步提高。

本试验利用对蓖麻碱和变应原具有较强降解力的SJM酵母菌对蓖麻饼粕进行固态发酵，研究不同辅料和添加剂等因素对蓖麻饼粕生物脱毒效果的影响。采用单因素试验和正交试验设计，对降解蓖麻碱和变应原的蓖麻饼粕培养基进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料 菌种：SJM酵母，本试验室筛选保存。

蓖麻饼粕（热榨）：由庆阳市农业科学研究院某植物蛋白生产基地提供，其主要成分含量：粗蛋白质35.67%，粗纤维33.87%，粗脂肪7.37%，粗灰分6.51%，蓖麻碱0.169%，变应原0.736%。

蓖麻碱标准品：纯度98%，最大吸收波长为312 nm，相对分子质量为164.16。

变应原标准品：按北京市粮食科学研究所情报资料室方法分离得到变应原，经SDS-PAGE电泳检测为纯品。

1.2 方法

1.2.1 蓖麻碱的提取和检测 准确称取蓖麻饼粕10.0 g索式抽提器中，加入氯仿150 mL，回流提取10 h，提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用甲醇充分溶解，过滤，于100 mL容量瓶定容，吸取1 mL定容在10 mL容量瓶中，用紫外分光光度计在312 nm波长处测定其吸光度，根据标准曲线，计算蓖麻碱含量。

1.2.2 变应原的提取和检测 准确称取经粉碎、过40目筛的样品20.0 g，置回流装置中，加蒸馏水200 mL微沸提取5 h，取上清液，减压浓缩，加入乙醇至25%，离心，取上清夜，加入适量的10%醋酸铅乙醇溶液，离心。调整上清液乙醇浓度为75%，离心，取沉淀，用缓冲生理盐水溶解，加入2 mL双缩脲试剂，用缓冲生理盐水定容至10 mL，充分混匀，于60℃水浴加热5 min，冷却至室温，于紫外分光光度计550 nm下测其吸光度。

1.2.3 辅料的选择 按15%接种量，将SJM酵母接入添加不同配比辅料的蓖麻饼粕中，底物组成见表1。调整其含水量为65%，121℃灭菌20 min，30℃培养5 d，取出，于50℃烘箱中干燥，粉碎，过40目筛备用。紫外分光光度法检测脱毒前后蓖麻碱和变应原含量。

表1 含有不同比例蓖麻饼粕的培养基组成 %

1.2.4 金属离子对蓖麻碱和变应原降解率的影响蓖麻饼粕85%，麸皮15%，调节培养基含水量为65%。分别按干基重添加0.4%的MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O、CuSO4·5H2O。 发酵条件不变。

1.2.5 CaCl2对蓖麻碱和变应原降解率的影响蓖麻饼粕85%，麸皮15%，CaCl2按干基重0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%添加，调整培养基含水量为65%。发酵条件不变。

1.2.6 KH2PO4对蓖麻碱和变应原降解率的影响蓖麻饼粕 85%，麸皮 15%，KH2PO4按干基重0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%添加， 调节培养基含水量为65%。发酵条件不变。

1.2.7 正交试验 以蓖麻饼粕作为固态发酵法降解蓖麻碱和变应原的基本培养基原料，选择麸皮、MgSO4·7H2O、CaCl2和 KH2PO4作为考察因素，根据单因素试验结果设计正交试验。优化SJM酵母脱毒培养基。

2 结果与分析

2.1 辅料的选择 由图1可以看出，SJM酵母菌接种到添加不同比例辅料的培养基后，都不同程度提高了蓖麻碱和变应原的降解率。在蓖麻饼粕培养基中添加麸皮对蓖麻碱和变应原的影响最大，蓖麻碱和变应原的降解率分别达到80.76%和83.78%。

图1 不同辅料配比对蓖麻碱和变应原降解率的影响

2.2 金属离子对蓖麻碱和变应原降解率的影响由图2可知，在培养基中添加0.4%的MgSO4·7H2O，蓖麻碱及变应原的降解率最高，分别为84.65%和 86.64%。 相反， 添加 FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O 和 CoSO4·H2O 后，蓖麻碱和变应原降解率下降，可能是Fe2+、Cu2+和Co2+影响了菌体的生长，抑制了酶的合成。

图2 金属离子对蓖麻碱和变应原降解率的影响

2.3 CaCl2对蓖麻碱和变应原降解率的影响 由图3可知，培养基中CaCl2的添加量在0.05%～0.2%时，酵母菌对蓖麻碱和变应原的降解率随着添加量的增大而提高，添加量为0.2%时，降解率最大。此后随着CaCl2添加量的增加，蓖麻碱和变应原降解率有所下降。

2.4 KH2PO4对蓖麻碱和变应原降解率的影响由图4可知，KH2PO4最适添加量为0.4%，过高和过低都不利于蓖麻碱和变应原的降解。

2.5 培养基的优化 根据单因素试验结果选择L9（34）正交表进行试验，因素与水平见表2。正交试验结果见表3。

图3 CaCl2添加量对蓖麻碱和变应原降解率的影响

图4 KH2PO4添加量对蓖麻碱和变应原降解率的影响

表2 因素与水平 %

表3 正交试验结果

由表4可知，各因素对蓖麻碱降解率的影响次序为麸皮＞ MgSO4·7H2O ＞ CaCl2＞ KH2PO4，最佳培养基组合为A2B2C2D3，即麸皮15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.5%。

表4 以蓖麻碱降解率为指标的极差分析结果

由表5可知，各因素对变应原降解率的影响次序为麸皮＞ KH2PO4＞ MgSO4·7H2O ＞ CaCl2，最佳培养基组合为A2B2C2D2，即麸皮15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.4%。

表5 以变应原降解率为指标的极差分析结果

综合蓖麻碱降解率和变应原降解率两个指标及经济原则，选择最佳培养基组合为A2B2C2D2，即麸皮 15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.4%。

2.6 验证试验 按最佳培养基组成，调整培养基含水量为65%，按15%接种量接入SJM酵母，30℃培养5 d，测得蓖麻碱平均降解率为86.95%，变应原平均降解率90.83%。

3 结论

3.1 单因素试验结果表明，辅料、金属离子及矿物质的添加对SJM酵母降解蓖麻饼粕中的蓖麻碱和变应原均有一定影响。

3.2 采用正交试验对SJM酵母发酵培养基进行优化，结果显示，最佳培养基组合为麸皮15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.4%，此时蓖麻饼粕中蓖麻碱和变应原的降解率均较高，分别为86.95%和90.83%。

[1]Dubey S K，Holmes D S.Biological cyanide destruction mediated by microorganisms[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，1995，11（3）：257 ～ 265.

[2]Pandey A，Soccol C R，Nigam P，et al.Biotechnological potential of agroindustrial residues II：Cassava bagasse[J].Bioresource Technology，1999，74：81 ～87.