耦联CD133/ABCG2抗体的荧光磁性纳米微粒的制备与靶向性实验

耦联CD133/ABCG2抗体的荧光磁性纳米微粒的制备与靶向性实验

黄跃英雷康熊虎殷香保黄长文

(南昌大学第二附属医院肝胆外科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的制备耦联抗CD133及ABCG2抗体的荧光Fe3O4纳米微粒，用于肝癌的早期诊断和癌细胞转移后的定位。方法采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子，在其外面包裹羧基化葡聚糖，然后与带有荧光基团的CD133及ABCG2抗体耦联，制备成一种可以检测CD133和 ABCG2双阳性细胞的免疫磁性纳米微粒，继而检测其表征和抗性；体外检测制备的磁性纳米微粒对人SP细胞的靶向性；肝癌 SP 细胞裸鼠皮下种植制作肝癌模型，尾静脉注射经筛选的纳米微粒，用荧光显微镜观察磁性纳米微粒的体内靶向作用。结果成功制备得到了具有磁性、粒度均匀的磁性纳米微粒，且在体内外均有荧光和对肿瘤干细胞的靶向性。结论成功制备得到了可用于检测CD133及ABCG2双阳性肝癌干细胞的免疫荧光磁性纳米微粒。

关键词〔〕肝癌干细胞；磁性纳米；抗体；CD133；ABCG2

中图分类号〔〕R735.7〔文献标识码〕A〔

基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目(No.GJJ 11309);江西省卫生厅科技计划项目(No.20131078);江西省科技计划项目(No.20132BBG70048);江西省自然科学基金资助项目(No.20114BAB205017)

通讯作者：黄长文(1967-)，男，博士，教授，主任医师，主要从事肝胆肿瘤与临床研究。

第一作者：黄跃英(1968-)，女，副主任护师，主要从事肝癌的基础研究。

肝癌是严重威胁人类身体健康的恶性肿瘤之一，在早期能够诊断出肝癌可以大幅度提高患者的存活率。肿瘤干细胞是癌症发生、 转移及复发的根源。如果能够检测到肿瘤干细胞的存在就提示恶性肿瘤的发生。通过检测细胞表面分子判断细胞类型是目前比较方便准确快捷的方法，通过检测细胞表面分子确定肿瘤干细胞的存在，可以成为癌症的诊断和治疗效果等临床阶段一种快速方便准确的检测方法。CD133是一种分子量为120 kD的跨膜蛋白，CD133+细胞亚群(SP细胞)具有较强的克隆形成和无限增殖的特性，是被广泛认可的肿瘤干细胞的特征性表面标记分子之一〔1〕。ABCG2是ABC转运蛋白家族中的一个成员，ABCG2主要存在于干细胞、某些肿瘤细胞和上皮细胞的顶膜，参与了肿瘤细胞的多药耐药性。所以普遍认为ABCG2和CD133+是肝癌干细胞最重要的表面标志物〔2〕。磁共振成像(MRI)技术是目前快速检测人体组织器官最有效的临床诊断手段之一，被广泛应用于组织器官病变检测尤其是肿瘤检测。磁性纳米颗粒可以使磁共振检测信号增强，所以可以作为磁共振造影剂应用于肿瘤的临床检测〔3〕。所以我们设想制备一种耦联抗 CD133 及 ABCG2 抗体的荧光 Fe3O4纳米微粒，并检测其在体内外的靶向性，为肝癌的超早期诊断奠定基础。

1材料与方法

1.1试剂与仪器FeCl3-6H2O(天津市福晨化学试剂厂)，FeCl2-6H2O(天津市福晨化学试剂厂)，NH4Fe(SO4)6H2O(株洲市化学工业所)，柠檬酸钠(河南焦作市化工厂)，葡聚糖T-70(Pharmacia公司)，溴乙酸(上海试剂四厂)，Zeta电位分析仪ZEN3600(Malvern公司)，透射电镜JEM-1230(Rigaku公司)，酶标仪(Bio-Rad 公司)，流式细胞仪(BD FACSCalibur，BD公司)，荧光显微镜(Olympus公司)。

1.2实验方法

1.2.1羧甲基葡聚糖(CMD)的制备称取2 g葡聚糖T-70，加入10 ml溴乙酸-NaOH溶液中，在室温下搅拌24 h。将溶液用三蒸水和0.1 mol/L的盐酸交替透析24 h ，然后冷冻干燥，可得到白色絮状CMD，4℃冰箱冷藏保存。

1.2.2CMD-Fe3O4的制备称取0.27 g FeCl3-6H2O、0.1 g FeCl2-6H2O和250 mg CMD，分别溶于10 ml三蒸水中并超声溶解，将三种溶液在氮气的保护下混合。通氮气下将溶液置于75℃水浴中搅拌，加氨水调节pH至10作用。继续搅拌约30 min后，取出后平衡至室温，然后用磁铁进行磁性分离。将沉淀用三蒸水洗涤至中性，冷冻干燥。

1.2.3CMD-Fe3O4与anti-CD133-GFP/anti-ABCG2作用分别称取 0.001 5 g anti-CD133-GFP/anti-ABCG2，溶于 1.5 ml 的10 mmol/L pH12 的PBS溶液中。称取0.01 g CMD-Fe3O4，溶解于2 ml的三蒸水中，超声溶解后取上层溶液，加入0.03 g EDC和0.01 g NHS，混合均匀，室温下活化羧基3 h，磁场下分离，分离后洗涤磁性纳米粒子二次。加入50 μl的抗体溶液和 950 μl中性10 mmol/L PBS，混匀后于 4℃反应 12 h。磁性分离后，用PBS溶液洗涤纳米粒子二次，既得免疫磁性纳米微粒。

1.2.4透射电镜取稀释10 000倍的样品溶液滴加到干净的铜网上，室温下晾干后在(23±2)℃的测试温度下进行检测。

1.2.5人肝癌SP细胞的提取分离首先将高转移人肝癌细胞株MHCC97-H接种到裸鼠皮下，在肿瘤直径达1.5 cm时无菌获取肿瘤，将肿瘤剪成约1 mm3大小，用Ⅱ型胶原酶(1 mg/ml)37℃孵育60 min将组织消化为细胞悬液，用PBS洗涤2次。将细胞在含生长因子的无血清培养基中进行培养，CD133+免疫磁珠法分选出CD133+SP细胞。将1×107细胞重悬于缓冲液中，充分吹打制备成单细胞悬液。将细胞悬液与稀释200倍的兔抗CD133多克隆抗体充分混匀后4℃避光孵育1 h，然后离心漂洗。加入稀释5倍的羊抗兔免疫二抗磁珠，轻轻震荡以充分混匀，于4℃共孵育15 min，离心后漂洗两次。弃上清，细胞中加入适量缓冲液充分吹匀后滴加到已外加磁场中的MS柱中，下接离心管。收集通过MS柱的细胞，即为未标记上的CD133阴性细胞。去掉外加磁场，向MS柱中加入适量缓冲液，将吸附在MS柱上的CD133阳性细胞加压推出，离心后收集细胞(CD133+SP细胞)。

1.2.6流式细胞术检测人SP细胞的荧光强度取分离获得的CD133+SP细胞1×107，加入10 μg磁性纳米微粒，混匀后37℃孵育6 h。处理后的细胞用PBS清洗后通过FACS Calibur (BD Bioscience)流式细胞仪检测，所得数据用WinMDI 2.9软件进行细胞表型分析。

1.2.7磁性纳米微粒体内靶向性的检测将分选所得SP细胞接种到裸鼠皮下，在肿瘤直径达1.5 cm时尾静脉注射磁性纳米微粒20 μg/只，6 h后用荧光显微镜观察肿瘤荧光强度。

2结果

2.1磁性纳米微粒的磁性检测将制备好的磁性纳米微粒冷冻干燥后分为相等的两份分别置于石英皿中，如图1中左图所示，在外加磁场的吸引下，微粒向磁铁方向聚集。

图1　磁性纳米微粒的磁性检测

2.2磁性纳米微粒的TEM图像图2可见，磁性纳米微粒的粒径大小50～75 nm，外形呈不规则球状，有一定团聚现象，分布较均匀。部分微粒的中心颜色较深，边缘部位的颜色较浅，这是因为其中心为Fe3O4，外周包裹了CMD。

2.3与磁性纳米微粒孵育后SP细胞的荧光强度如图3所示，左图为未同磁性纳米微粒孵育的SP细胞的结果(阴性对照组)，右图为共孵育后SP细胞的GFP的表达水平，可见制备所得的磁性纳米微粒对SP细胞在体外有较好的细胞靶向作用。

图2　磁性纳米微粒的TEM图

图3　磁性纳米微粒对SP细胞的靶向性

2.4磁性纳米微粒的体内靶向作用如图4所示，注射磁性纳米微粒后，肿瘤部位显示可检测到的荧光，而对照组未检测到荧光，说明磁性纳米微粒在体内也有良好的靶向性。

图4　荷瘤裸鼠尾静脉注射磁性纳米微粒后肿瘤的荧光强度

3讨论

癌症的诊断方法一直不尽人意，一般确诊的癌症都是晚期，癌症的早期诊断一直是业界的一个难题。肿瘤组织中存在含量极少、具有无限增殖潜能的肿瘤干细胞，这些高致瘤性肿瘤干细胞是引起肿瘤难以治愈的根源。肝癌干细胞的来源及其表面标志物还存在争议。ABCG2、CD133、CD34、CK7、c-ki等可能是人肝癌干细胞的部分表型标志。国内外学者通过侧群细胞技术及CD133鉴定和分离得到具有很强的体外克隆形成及体内成瘤能力的SP细胞〔3〕，而且与CD133-肝癌SP细胞相比，CD133+肝癌SP细胞具有更强的克隆形成和增殖能力〔3，4〕；通过从人肝癌组织中分离肝癌干细胞样细胞的研究发现，裸鼠皮下接种2 000个SP细胞的成瘤率为100%〔5〕。另一组国内的临床研究发现，肝癌组织中CD133-患者的平均生存率较CD133+患者显著延长，提示CD133不仅与肝癌的发生、发展相关，还有望成为判断患者预后的指标之一〔6〕。

多药抗性的产生常常伴随着ABC家族中一个或几个成员的过表达，特别是ABCG2蛋白的过表达。该转运蛋白是P-糖蛋白，由多药抗性蛋白(MDR)1的基因和多药抗性相关蛋白(MAP)的基因编码。作为一个具有广泛底物作用的特异性外排泵，ABCG2主要存在于干细胞、某些肿瘤细胞和上皮细胞的顶膜。研究表明，ABCG2是肿瘤干细胞主要的ABC转运蛋白，SP细胞通过ABCG2将荧光活性染料Hoechst33342排出细胞

外，正是据于此，SP细胞被鉴定、分离。 ABCG2在SP中呈高表达还使进入细胞中的药物被排出胞外，故该功能被认为参与了肿瘤细胞的多药耐药性。目前，很多学者研究证实、认可了ABCG2和CD133+细胞在原发性肝癌中的干细胞作用，并认为ABCG2和CD133+是肝癌干细胞最重要的表面标志物。

磁性纳米粒子是将Fe3O4制备成纳米级微粒，由于其具有磁性这一特性，且可以与多种无机或有机分子结合，在生物医学领域逐渐获得广泛应用。将磁性微球包被有免疫活性的物质称为免疫磁珠(IMMs)，是一种进行免疫学或者生物学分析分离等应用的一种技术〔7,8〕。近年来，利用免疫磁珠对各种细胞进行定位、分离和检测的方法引起了广泛关注和研究。如Grossman等〔9〕将免疫磁珠和超导电子干涉装置联合运用，用于特定细菌的检测。

本实验结果表明，我们制备得到的磁性纳米微粒具有均匀的粒径、良好的磁性和体内外靶向性，该结果有望在肝癌干细胞出现(瘤体尚未形成或极微小)时就有可能检测并定位肝癌，为肝癌的超早期诊断和靶向肝癌干细胞治疗奠定了基础。

4参考文献

1Shmelkov SV,Jun L,St Clair R,etal.Alternative promoters regulate transcription of the gene that encodes stem cell surface protein AC133〔J〕.Blood,2004;103( 6):2055-61.

2谢超,裴雪涛.ABCG2/Bcrp1转运蛋白:侧群干细胞的表型标记与功能调控蛋白〔J〕.生理科学进展，2003;34(1)：57-9.

3Suetsugu A， Nagaki M， Aoki H，etal.Characterization of CD133+hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006;351(4)：820-4.

4Ma S， Chan KW， Hu L，etal.Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells〔J〕.Gastroenterology，2007;132(7)：2542-56.

5Chiba T,Kita K,Zheng YW,etal.Side population purified from hepatocellular carcinoma cellsharbors cancer stem cell-like properties〔J〕.Hepatology,2006;44(1):240-51.

6陈书德,宋文杰,张福琴,等.干细胞表面标志物CD133在肝癌组织中的表达及其临床意义[J]. 第四军医大学学报，2009;30(5)：458-61.

7Tu S,Reed S,Gehring A,etal.Capture of Escherichia coli 0157:H7 using immunomagnetic beads of different size and antibody conjugating chemistry 〔J〕.Sensors,2009;9(2):717-30.

8Samuel D,Ibrahim M,Arne H,etal.Improved sample preparation for real-time PCR detection of listeria monocytogenes in hot-smoked salmon using filtering and immunomagnetic separation techniques 〔J〕.Food Anal Meth,2009;2(1):23-9.

9Grossman H,Myers W,Vreeland V,etal.Detection of bacteria in suspension by using a superconducting quantum interference device〔J〕.J Proc Natl Acad Sci USA,2004;101(1):129-34.

〔2013-12-21修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)