脾脏免疫细胞在胃溃疡期间的变化及作用

脾脏免疫细胞在胃溃疡期间的变化及作用

张江兰张敏1邢琛琨任君旭张静吴靖芳

(河北北方学院，河北张家口075000)

摘要〔〕目的探讨实验性胃溃疡大鼠脾脏树突细胞(DC)、巨噬细胞(Mφ)和T细胞的变化和作用。方法胃前壁胃黏膜下注射冰乙酸制备大鼠胃溃疡模型，免疫组织化学检测正常组(5只)、盐水组(28只)和溃疡组(35只)雄性大鼠脾脏DC、Mφ和T细胞的变化。结果溃疡组、盐水组和正常组相比，DC、Mφ和T细胞数量均增多。溃疡2～10 d组DC数密度值逐渐增多,14 d后其值略有降低，其中6 d其值与盐水组相比差异显著(P<0.05)，6～14 d各组其值与正常组相比差异显著(P<0.05，P<0.01)；溃疡组2～4 d组Mφ数密度值逐渐增多，6～14 d其值逐渐降低，各组其值均高于盐水组和正常组(P<0.05，P<0.01);溃疡组2～6 d T细胞数密度值持续增多,10 d后其值逐渐降低，其中4～10 d组其值与正常组相比差异显著(P<0.01)。结论DC和T细胞在溃疡期间脾脏中数量增多，通过提高脾脏免疫反应性促进胃溃疡愈合；溃疡期间Mφ数量增多，提示Mφ在溃疡形成和自愈机制中起一定的作用。

关键词〔〕胃溃疡；树突细胞； 巨噬细胞；T细胞；免疫组化

中图分类号〔〕R573.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：张家口市科技攻关计划(12110065G-1)；河北北方学院自然科学研究计划项目(No.2001022)

通讯作者：任君旭(1966-)，男，教授，硕士生导师，主要从事溃疡病研究。

1张家口学院

第一作者：张江兰(1981-)，女，讲师，主要从事溃疡病研究。

一般认为胃溃疡是胃黏膜攻击因子相对增强或防御因子相对减弱,二者失衡所引起。胃溃疡愈合不是孤立的，它受全身神经-免疫-内分泌系统网络的调节。脾脏作为全身最大的周围淋巴器官，是机体神经-免疫-内分泌网络调节中心的一个重要组成部分，在机体的免疫调节中有着重要的不可替代的作用，拥有大量淋巴细胞、树突细胞(DC)、巨噬细胞(Mφ)等免疫细胞，是其执行免疫功能的基础。本文探讨胃溃疡期间脾脏DC、 Mφ和T细胞改变在胃溃疡形成和自愈过程中的免疫调节作用。

1材料和方法

1.1动物与分组8周龄SD雄性大鼠共68只。大鼠分为实验性胃溃疡组(溃疡组)35只，盐水组28只，正常组5只，体重180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司购买。

1.2大鼠实验性胃溃疡模型的制作及取材溃疡组大鼠按冰乙酸制实验性胃溃疡模型方法〔1〕，用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉。胸腹部剃毛、消毒，在无菌条件下暴露胃。在胃前壁近胃窦处将0.01 ml 冰醋酸注入胃黏膜下层。将大网膜覆盖于注射区后，逐层缝合腹壁切口。盐水组模拟手术,注射等量生理盐水代替冰醋酸。正常组不作任何处理。取材前禁食12 h，不限饮水。动物被麻醉后，迅速开胸，主动脉插管，剪开右心耳，首先灌注生理盐水100 ml，继之灌注4% 多聚甲醛250 mL，维持20 min。在造模后2、4、6、10和14 d分批取材，从脾截取1 cm长组织条，置于Bouin液中固定18～24 h，逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。连续切片，片厚4 μm，裱贴于涂有APES的载玻片，行HE染色和免疫组化染色。

1.3HE染色切片经脱蜡、染色、脱水、透明和封片，进行组织学观察。

1.4免疫组化染色石蜡切片常规脱蜡至水，进行柠檬酸缓冲液(pH6.0)92℃～98℃水浴锅修复10 min，室温冷却；作定位研究的邻片以柠檬酸缓冲液(pH6.0)高压修复5 min，室温冷却；30 g/L H2O2-甲醇室温20 min，100 g/L正常羊血清室温孵育30 min，倾去多余的血清，滴加兔抗大鼠CD3多克隆抗体(工作浓度为1∶100)、兔抗大鼠S-100多克隆抗体(工作浓度为1∶100)和兔抗大鼠Lysozyme多克隆抗体(工作浓度为1∶150)，购自武汉博士德生物技术有限公司，4℃湿盒中过夜；滴加生物素标记Ⅱ抗，37℃孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37℃孵育30 min；DAB-H2O2液显色后，苏木精复染细胞核。正常兔血清代替一抗作阴性对照，余步骤相同。

1.5形态计量和图像分析用OLYMPUS-CX31显微镜连接MiE显微图像处理软件在计算机上进行观察；在光镜下观察S-100和Lysozyme阳性反应物呈棕黄色颗粒状分布于各细胞的胞质中，CD3阳性反应物呈棕黄色颗粒状分布于各细胞的胞膜，分别以胞质内和胞膜出现棕黄色颗粒视为阳性细胞。用成像系统在显微镜下随机圈定面积，每只动物随机圈定10个面积，在高倍镜下计数所选区域阳性细胞数，通过计算阳性细胞的数密度对各组进行统计分析；阳性细胞数密度(NA)=阳性细胞数目/所选面积。

1.6统计学处理采用SPSS13.0 软件行ANOVA方差分析及q检验。

2结果

2.1脾脏DC在胃溃疡期间的变化在正常脾脏中DC多为分枝形，主要分布于B细胞区和边缘区，动脉周围淋巴鞘和红髓中也有少量散在分布；在动脉周围淋巴鞘和B细胞区的体积较大，突起较粗、长；边缘区有DC呈环行排列。溃疡组与盐水组和正常组相比DC数量均增多(图1)。溃疡2～10 d组B细胞区DC越来越密集，动脉周围淋巴鞘DC增多，边缘区DC密集、数量增多明显，在10 d其NA值达到最高值，从14 d后逐渐减少，但仍维持在一个较高的水平。其中6 d NA值与前一溃疡组和盐水组的相比显著增高(P<0.05)，6～14 d各组NA值与正常组的相比显著增高(P<0.05或P<0.01)。而盐水组的变化趋势与溃疡组一致，脾脏各部位DC数量与溃疡组相比数量少，分布稀疏，10 d与正常组相比NA值明显增高(P<0.05)。见表1。

2．2脾脏Mφ在胃溃疡期间的变化脾脏Mφ主要分布于红髓，边缘区也有少量分布，白髓中分布很少。溃疡各组Mφ数量与对照组和正常组相比均显著增多(P<0.05或P<0.01)(图2)。溃疡2～4 dMφ数密度值持续增多明显高于对照组和正常组(P<0.01)，以红髓中变化最明显；6～14 d其NA值稍微逐渐降低10 d后NA值逐渐降低，但仍明显高于对照组和正常组(P<0.01)。对照组变化趋势与溃疡组一致，其中2～10 d各组与正常组相比差异显著(P<0.05或P<0.01)。见表2。

盐水组　　　　　　　　　　　溃疡组 图1　盐水组和溃疡组脾脏DC细胞分布(IHC，×400)

组别n2d4d6d10d14d溃疡组571.8±19.375.3±7.493.3±18.01)2)3)97.7±21.91)87.2±20.81)2)盐水组2864.2±14.171.4±16.578.0±16.486.5±16.869.4±12.4正常组3555.5±13.355.5±13.355.5±13.355.5±13.355.5±13.3

与正常组比较:1)P<0.05；与相应盐水组比较：2)P<0.05；与前一溃疡组比较：3)P<0.05，下表同

2.3脾脏T细胞在胃溃疡期间的变化正常脾脏T细胞主要分布于脾动脉周围淋巴鞘，边缘区和红髓中也有散在分布。溃疡组与盐水组和正常组相比各组T细胞数量均增多(图3)。在溃疡组2～6 d T细胞数量持续增多，在6 d组NA值达到高峰，在10 d组NA值略微有所降低，14 d降低显著(与10 d相比P<0.05)但仍高于盐水组，其中溃疡4～10 d组NA值与正常组的相比差异性显著(P<0.01)。溃疡组以脾动脉周围淋巴鞘T细胞数量增加最为显著；边缘区T细胞在2 d增加明显，而后逐渐减少；红髓T细胞在损伤后逐渐增加，在14 d也维持在一个较高水平。盐水组从术后2 d开始T细胞数量逐渐缓慢增高，在14 d维持在一个较高的水平。见表2。

盐水组　　　　　　　　　　　溃疡组 图2　盐水组和溃疡组脾脏Mφ细胞分布(IHC,×400)

盐水组　　　　　　　　　　　溃疡组 图3　盐水组和溃疡组脾脏T细胞分布(IHC，×400)

组别n Mφ T细胞 2d4d6d10d14d2d4d6d10d14d溃疡组575.6±25.81)2)82.8±19.71)2)70.4±29.21)2)67.7±31.31)2)43.0±27.71)2)218.0±61.2322.4±51.81)2)3)358.9±121.31)2)346.6±22.61)2)249.8±39.93)盐水组2838.4±13.459.6±17.92)3)53.3±11.848.4±9.32)31.9±15.1209.8±71.2229.2±67.8239.4±51.5219.3±34.4205.3±47.0正常组3525.5±11.325.5±11.325.5±11.325.5±11.325.5±11.3190.2±28.9190.2±28.9190.2±28.9190.2±28.9190.2±28.9

3讨论

抗原提呈细胞能通过激活、诱导静息型T细胞的分化，引发机体的免疫应答或免疫耐受，是机体免疫应答的始动者。DC和Mφ是最重要的专职抗原呈递细胞，在免疫应答中起关键的引导和调节作用。脾脏DC大部分为未成熟DC ，具有活性的成熟DC含量较少。未成熟DC在机体受到刺激，摄取抗原后，逐渐成熟，抗原提呈能力增强，转化为成熟DC。S-100蛋白通常为未成熟DC的标志物〔2〕。本文结果提示胃溃疡期间大鼠免疫系统的启动机制明显增强。DC呈S-100蛋白阳性，通过S-100蛋白调节T细胞内的钙离子浓度,具有很强的提呈抗原和刺激T细胞的能力〔3〕；DC与B细胞通过CD40L-CD40耦联和上调B7分子直接刺激B细胞产生大量IgG和IgM，增强体液免疫。同时，DC 通过在体内迁移而发挥强大的抗原提呈功能，从外周非淋巴组织迁移进入次级淋巴组织〔1〕，如心脏、肾脏间质中的DC在局部获取抗原后通过血液到脾脏，DC移行到脾脏T细胞区定居下来〔4，5〕，诱导免疫应答。在本实验制作的胃溃疡模型中，在胃溃疡形成时期主要由于冰乙酸的刺激，使胃黏膜DC大量处理抗原，随淋巴细胞再循环到达脾脏，首先引起边缘区的改变，向动脉周围淋巴鞘胞迁移，并在动脉周围淋巴鞘定居下来诱导细胞免疫。本实验结果也显示溃疡组CD3+T细胞数量均增高，且以动脉周围淋巴鞘数量增多最为显著，并存在激烈的细胞免疫应答。

脾脏是Mφ的主要储存器官，Mφ是专职的抗原提呈细胞，在机体非特异性和特异免疫中都起着重要的作用，能将加工、处理后的抗原肽通过表面的MHC分子传递给T细胞，启动细胞免疫应答。溶菌酶(Lysozyme)是Mφ的标志性表达产物〔6〕。本文发现溃疡各组Mφ数量明显增多，主要分布于红髓髓索中。Mφ是构成血脾屏障的主体细胞，可以在脾索的间隙中移行、捕捉、吞噬衰老的红细胞、异物和抗原物质〔7〕。本实验结果显示，2～4 d组Mφ数密度值逐渐升高，而6 d后其值逐渐降低，但仍维持在高水平。本组曾证实〔8〕在胃溃疡期间Mφ吞噬功能增强，处理红细胞速度加快，说明Mφ处于激活状态，Mφ激活后可受多种细胞因子诱导而合成NO，高水平的NO 可以产生细胞毒作用〔9〕。有研究显示被激活的Mφ含有大量的Mφ移动抑制因子〔10〕可损伤胃黏膜细胞，而脾脏Mφ在胃溃疡形成和愈合过程中是参与溃疡黏膜的修复，还是参与溃疡的形成，其具体机制有待于进一步研究。

总之， DC、Mφ和T细胞是非常重要的免疫细胞，各细胞在体内的分布和数量与疾病过程密切相关。DC和T细胞对提高溃疡期间脾脏的免疫反应性以促进溃疡的愈合起到了重要的作用，而溃疡期间Mφ数量的改变，提示Mφ在溃疡的形成和自愈机制中发挥一定的作用。

4参考文献

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9杨卓顺.低剂量甲氨蝶呤下调巨噬细胞iNOS表达抑制肝脏炎性损伤〔D〕.华中科技大学,2011.

10Huang XR,Chun CW,Chen YX,etal.Macrophage migration inhibitory factor is an important mediator in the pathogenesis of gastric inflammation in rats〔J〕.Gast Roent Erol,2001;121(3):619-30.

〔2014-09-18修回〕

(编辑曹梦园)