粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠血肿周围组织中Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠血肿周围组织中Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

肖兴花

(临沂市沂水中心医院，山东临沂276400)

摘要〔〕目的探讨粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠血肿周围组织中Bax及Bcl-2蛋白表达的影响。方法将成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑出血组、处理组，采用称重法测定脑组织的含水量，采用Western印迹法检测脑组织中Bax及Bcl-2的蛋白表达情况。结果结果：①脑水肿程度：手术后6、12、24、48 h时，脑出血组大鼠的脑组织含水量高于假手术组，治疗组大鼠的脑组织含水量低于脑出血组；②Bax及Bcl-2蛋白表达：脑出血组大鼠脑组织Bcl-2的蛋白含量低于假手术组，Bax的蛋白含量高于假手术组；治疗组大鼠大鼠脑组织Bcl-2的蛋白含量高于脑出血组，Bax的蛋白含量低于脑出血组。结论粒细胞集落刺激因子治疗能够改善实验性脑出血大鼠的脑组织水肿程度、调节Bax及Bcl-2表达、抑制细胞凋亡，可能成为治疗脑出血的理想方法。

关键词〔〕脑出血；粒细胞集落刺激因子；凋亡分子；Bax；Bcl-2

中图分类号〔〕R743〔文献标识码〕A〔

第一作者：肖兴花(1966-)，女，副主任医师，主要从事脑血管病研究。

脑出血是临床常见的神经系统急症，临床上多采用血肿清除术进行治疗，但是患者多会残留神经功能损害并对日常生活造成影响。改善脑出血后神经功能的恢复情况是临床研究的热点。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有动员骨髓干细胞的功能，进而对神经功能进行修复〔1〕。Bax、Bcl-2是目前发现的凋亡调节蛋白因子，而细胞凋亡是被认为引起脑出血后神经功能缺损最重要的机制〔2〕。本研究分析了粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠血肿周围组织中Bax及Bcl-2蛋白表达的影响。

1对象与方法

1.1对象成年雄性SD大鼠60只，由大学动物中心提供。体重280～320 g，鼠龄2～3个月。采用随机数字表法分为假手术组、脑出血组、治疗组各20只。根据6、12、24、48 h断头时点不同分为四个亚组各5只。

1.2仪器与试剂仪器：头颅立体定位仪由大学神经生物实验室提供；电子天平：BS110S型(中国Sartorius)；显微镜：Olympus多功能显微镜(日本)；病理组织包埋机：中国BMZ-3型；台式离心机：TGL-16G(上海)；微量注射器：世界精密仪器商贸(上海)有限公司。试剂rhG-CSF：麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司；Bax、Bcl-2多克隆抗体：武汉博士德公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3处理方法脑出血组、治疗组在给予10%戊巴比妥钠腹腔麻醉后以俯卧位固定，切开头皮后采用脑立体定位仪选择尾状核(前囟前0.2 mm，中线右侧旁开3 mm，深6 mm)处作为注射点，注入取自尾部的不凝血50 μl，而后缓慢退针，采用骨蜡局部封闭并缝合切口，采用神经功能缺损评分，1～4分提示大鼠脑出血模型建模成功。手术后1 h，治疗组腹腔注射60 μg/kg rhG-CSF，脑出血组注射等量生理盐水。假手术组在手术造模时，用等量生理盐水替代不凝血注射进入颅内，术后接受生理盐水腹腔注射。术毕大鼠自由活动进食进水。

1.4观察指标

1.4.1脑组织含水量手术后6、12、24、48 h时，采用断头法处死大鼠，开颅取出脑组织，取出脑膜、低位脑干和小脑组织，保留大脑组织并用电子天平称量湿重，而后将脑组织放在恒温电烤箱中100℃烘烤24 h，使水分充分蒸发，而后用电子天平称量干重。参照Elliott公式计算脑组织含水量，含水量为(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4.2脑组织中Bax、Bcl-2蛋白含量检测取脑组织，加入RIPA裂解液抽提蛋白，采用Western印迹检测蛋白含量，设定手术后6 h时假手术组的蛋白含量为100，计算其他时间点、其他组蛋白含量的相对值。

2结果

2.1脑组织含水量经方差分析，三组间脑组织含水量有差异(P<0.05)；LSD两两比较显示，脑出血组大鼠的脑组织含水量高于假手术组，治疗组大鼠的脑组织含水量低于脑出血组(P<0.05)。见表1。

2.2脑组织Bcl-2、Bax的蛋白含量三组间脑组织Bcl-2的蛋白含量有差异(P<0.05)；脑出血组大鼠脑组织Bcl-2的蛋白含量低于假手术组；Bax蛋白含量高于假手术组治疗组大鼠大鼠脑组织Bcl-2的蛋白含量高于脑出血组，Bax含量低于脑出血组(均P<0.05)。见表2，表3。

表1　三组大鼠脑组织含水量比较

表2　三组大鼠脑组织Bcl-2的蛋白比较

表3　三组大鼠脑组织Bax的蛋白比较

3讨论

rhG-CSF能够动员骨髓干细胞(BMSC)向脑损伤部位迁移并在局部对坏死的脑组织进行修复，进而促进神经功能的恢复〔3〕。BMSC在神经系统局部能够产生成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)，促进神经元细胞在局部完成黏附、增殖、分化的过程，有利于神经功能的修复〔4〕；同时，BMSC也能产生神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)，有利于脑出血局部血供重建、神经功能的恢复〔5〕。此外，由rhG-CSF动员而募集的BMSC具有抗炎的作用，能够减轻局部神经细胞所受到的损伤〔6〕。

近年来，越来越多的研究报道了rhG-CSF治疗脑血管疾病的价值，通过动员BMSC保护神经元细胞、修复神经功能、缓解脑组织局部水肿〔7〕。脑组织水肿是脑出血后最重要的病理改变，也是造成神经功能损伤的关键环节，通过称量脑组织的干重和湿重并计算差值可以反映脑组织的水肿程度〔8〕。本研究说明脑出血模型建立后脑组织发生水肿，而在进行rhG-CSF治疗后能够改善脑组织水肿的情况，有利于神经功能的恢复。

细胞凋亡是一种基本的生理现象，对于维持机体内环境的稳态具有重要价值，具体是指细胞在内外环境刺激因素作用下发生的自主有序的死亡过程。该过程有助于清除体内异常的细胞并且受到了多种基因的调控。Bcl家族是体内重要的凋亡调控基因，包括了抗凋亡基因和促凋亡基因两大类型，前者的代表是Bcl-2，主要通过作用于线粒体细胞色素C来发挥抗凋亡的作用〔9〕；后者的代表是Bax，通过与Bcl-2形成异源二聚体来阻断Bcl-2的抗凋亡作用，启动细胞凋亡的程序〔10〕。此外，Bcl-2还具有神经保护功能，可以保护神经细胞免受氧自由基以及脂质过氧化产物的损伤〔11〕。

在脑出血的发生过程中，脑组织血供中断且受到局部血肿的压迫，会激活细胞凋亡的程序，使神经功能发生损伤。在本研究中，通过分析假手术组和脑出血组大鼠脑组织中凋亡调节分子的表达量，进一步说明脑出血大鼠模型建立成功，血肿周围组织中细胞发生凋亡；而脑出血大鼠在接受rhG-CSF治疗后，血肿周围组织内神经细胞的凋亡过程受到抑制，有利于神经细胞的增殖以及神经功能的重建。

本文研究表明，粒细胞集落刺激因子治疗能够改善实验性脑出血大鼠的脑组织水肿程度、调节Bax及Bcl-2表达、抑制细胞凋亡，可能成为治疗脑出血的理想方法。由于自身能力及实验条件的限制，本文难以深入提示粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠血肿周围组织中Bax及Bcl-2蛋白表达影响的作用机制，有待于更多的临床与实验研究去探索。

4参考文献

1何晓英，付华，袁平，等.粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠的治疗机制〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(9):2486-9.

2Charles MS,Ostrowski RP,Manaenko A,etal.Role of the pituitary-adrenal axis in granulocyte-colony stimulating factor-induced neuroprotection against hypoxia-ischemia in neonatal rats〔J〕.Neurobiol Dis,2012；47(1):29-37.

3何晓英，谭华，袁平，等.重组人粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠星形胶质细胞表达的影响〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2009；13(32)：6263-6.

4Pastuszko P,Schears GJ,Pirzadeh A,etal.Effect of granulocyte-colony stimulating factor on expression of selected proteins involved in regulation of apoptosis in the brain of newborn piglets after cardiopulmonary bypass and deep hypothermic circulatory arrest〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg,2012；143(6):1436-42.

5Grace MB,Singh VK,Rhee JG,etal.5-AED enhances survival of irradiated mice in a G-CSF-dependent manner,stimulates innate immune cell function,reduces radiation-induced DNA damage and induces genes that modulate cell cycle progression and apoptosis〔J〕.J Radiat Res,2012；53(6):840-53.

6贾丽君，范佳，刘群.重组人粒细胞集落刺激因子对大鼠脑出血后神经功能损伤的保护〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(4):513-5.

7张涓，张恩户.重组人粒细胞集落刺激因子联合丹参酮ⅡA与丹皮酚配伍对脑缺血大鼠骨髓干细胞动员的影响〔J〕.中国医院药学杂志，2014；34(2):90-4.

8Baldo MP,Davel AP,Damas-Souza DM,etal.The antiapoptotic effect of granulocyte colony-stimulating factor reduces infarct size and prevents heart failure development in rats〔J〕.Cell Physiol Biochem,2011；28(1):33-40.

9李晓飞，文益民，张增山，等.G-CSF对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及Bc1-2、Bax蛋白表达的影响〔J〕.中国骨肿瘤骨病，2010；9(5):441-6.

10李肖云，兰希发，王玉琳，等.粒细胞集落刺激因子与血管性痴呆大鼠海马凋亡相关蛋白〔J〕.中国组织工程研究，2012；16(36):6741-7.

11付振虹，董蔚，盖鲁粤，等.探讨重组人促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子联合应用对缺氧心肌细胞保护的分子机制〔J〕.中国体外循环杂志，2012；10(4):227-31.

〔2014-06-17修回〕

(编辑袁左鸣)