MicroRNA-126对人正常肝细胞株脂代谢的影响

MicroRNA-126对人正常肝细胞株脂代谢的影响

胡志为何亚非刘艳霞栗夏莲

(郑州大学第一附属医院内分泌科，河南郑州450052)

摘要〔〕目的探讨循环中MicroRNA-126在1型和2型糖尿病影响肝细胞的糖代谢及对正常肝细胞系Chang liver细胞脂代谢的影响。方法以人正常肝细胞系为对象，设置MicroRNA-126 mimics转染组、MicroRNA-126 inhibitor转染组、阴性对照组、阴性对照抑制组、转染试剂组与正常对照组。通过转染MicroRNA-126类似物及拮抗物，改变MicroRNA-126表达。RT-PCR法检测各组细胞中MicroRNA-126的表达量；转染MicroRNA序列48 h后，继而胰岛素作用12 h，甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)定量检测试剂盒检测每组肝细胞内TG和TC的含量。结果RT-PCR结果显示MicroRNA-126 mimics转染组较正常对照组的MicroRNA-126 表达量显著增加(t=26.18，P<0.05)，其余各组较正常对照组的MicroRNA-126表达量则无显著差别(P=0.609)。胰岛素作用后，MicroRNA-126 mimics转染组、MicroRNA-126 inhibitor转染组、阴性对照组、阴性对照抑制组、转染试剂组与正常对照组相比，TG和TC含量无显著差别(F=1.074，0.436，均P>0.05)。结论MicroRNA-126对正常肝细胞株TG及TC的代谢可能没有影响。

关键词〔〕MicroRNA-126；人正常肝细胞株；脂代谢

中图分类号〔〕R39〔文献标识码〕A〔

基金项目：河南省卫生厅省部共建项目(No.201201015)

通讯作者：栗夏莲(1961-)，女，主任医师，硕士生导师，主要从事内分泌代谢疾病诊断治疗研究。

第一作者：胡志为(1988-)，女，硕士，主要从事内分泌代谢疾病诊断治疗研究。

MicroRNAs对自身稳态和疾病的发生有着重要的影响〔1〕，可以和靶信使RNA(mRNA) 的非编码区(-UTRs)结合，抑制编码蛋白基因的转录后表达〔2〕。近年来研究发现MicroRNAs与2型糖尿病(T2DM)的发生发展有密切联系，糖尿病病人血浆中MicroRNA-126的表达明显降低，动物模型也得到了验证〔3〕。前期工作证实MicroRNA-126可促进糖异生并且降低葡萄糖的利用率。糖尿病是一种糖脂病，肝脏在糖脂代谢中起重要作用。本实验通过对正常肝细胞转染MicroRNA-126类似物，测定转染后细胞内甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)的含量，旨在探讨MicroRNA-126对肝细胞脂代谢功能的影响。

1材料与方法

1.1材料和试剂人正常肝细胞系Chang liver由我院临床药学实验室馈赠；胎牛血清购自四季青公司；改良型RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；MicroRNA-126类似物等核苷酸片段由上海吉玛制药技术有限公司合成；转染试剂脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen 公司；RNAiso for small RNA试剂、 PrimeScript RT reagent Kit均购自TaKaRa公司；逆转录和荧光实时定量PCR检测所用引物由广州锐博公司提供；TG、TC检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验方法

1.2.1Chang liver细胞的培养液氮中取出Chang liver细胞，37℃快速解冻，放入含10%胎牛血清、1%青链霉素的改良型RPMI-1640培养基中，置于37℃ 、5%CO2的培养箱中培养，2～3 d传代。

1.2.2最佳转染条件的筛选取对数生长期细胞以适宜密度接种于24孔板，细胞生长至70%时，用无血清无抗生素培养基孵育4 h，脂质体Lipofectamine 2000转染不同浓度荧光标记的无意对照序列(FAM-NC及inhibitor FAM-NC)(20、40、80 nmol/L)，6 h后通过荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的强度来确定最佳转染浓度。

1.2.3人工合成RNA转染及细胞内MicroRNA-126检测选取适宜MicroRNA序列转染浓度(80 nmol/L)，转染步骤同上，提取细胞内RNA。Prime Script RT reagent Kit 进行RT-PCR，20 μl体系中包括1 μl RNA 模板，逆转录生成cDNA，以cDNA 为模板，分别对每组细胞中MicroRNA-126和U6内参进行实时荧光定量PCR扩增。广州锐博公司提供逆转录和荧光实时定量PCR检测所用引物，产品编号为：has-miR-126-3p RT primer：15373.60；has-miR-126-3p Forward primer：9641.02；has-miR-126-3p Reverse primer：10239.41；U6 RT Primer：6092.02；U6 Forward primer：5131.39；U6 Reverse primer：6092.02。cDNA第一链反应条件：42℃，1 h；70℃，10 min；PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性10 s；60℃退火20 s；70℃延伸30 s，扩增45个循环。Ct比较法计算目的基因转录水平(2-ΔΔCt)。

1.2.4细胞内TG、TC含量的测定细胞转染48 h后用胰岛素处理12 h，胰酶消化细胞，将细胞悬液取出，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2遍，1 000 r/min离心10 min，弃上清，留细胞沉淀，加入200 μl PBS液，冰水浴条件下超声破碎，制备好的匀浆液不离心待测，按空白组，校准组，样品组分别加样，混匀后37℃孵育5 min，可见光分光光度计500 nm波长处检测各组吸光度值，BCA法进行蛋白定量，计算每毫克蛋白对应的TG和TC的含量，以排除细胞数的影响，每个样品设3个复孔。

2结果

2.1肝细胞最佳转染条件的筛选细胞生长至70%后，脂质体Lipofectamine 2000转染不同浓度(20、40、80 nmol/L)的荧光标记的无意对照序列(FAM-NC及inhibitor FAM-NC)，6 h后荧光显微镜下观察细胞中的绿色荧光，FAM-NC及inhibitor FAM-NC可以有效的转染细胞，并且呈现浓度依赖性。见图1。

A：FAM-NC 20 nmol/L；B：FAM-NC 40 nmol/L；C：FAM-NC 80 nmol/L；D：inhibitor FAM-NC 20 nmol/L；E：inhibitor FAM-NC 40 nmol/L；F：inhibitor FAM-NC 80 nmol/L 图1　荧光显微镜观察细胞内绿色荧光(　　　)

2.2细胞内MicroRNA-126的检测MicroRNA-126 mimics转染组细胞中MicroRNA-126 的相对表达量(789.67±65.77)较正常对照组(设为1.00)显著增加(t=26.18，P<0.05)；MicroRNA-126 inhibitor转染组(0.87±0.23)、阴性对照组(1.04±0.08)、阴性对照抑制组(1.00±0.17)、转染试剂组(0.87±0.35)及正常对照组MicroRNA-126表达量之间的差异无明显统计学意义(P=0.609)。

2.3Chang liver细胞内TG及TC含量的变化正常对照组细胞经胰岛素处理后，TG及TC含量明显增加〔TG：(337.60±33.23)mg/g蛋白 vs (173.60±18.04)mg/g蛋白；TC：(309.67±60.90)mg/g蛋白 vs (144.81±7.56)mg/g蛋白〕(t=10.76，P<0.01)，证明细胞对胰岛素的脂代谢作用反应良好。胰岛素作用后，MicroRNA-126 mimics转染组〔TG：(383.89±56.43)mg/g蛋白，TC：(352.88±44.99)mg/g蛋白〕、MicroRNA-126 inhibitor转染组〔TG:(353.80±43.89)mg/g蛋白，TC：(329.53±49.89)mg/g蛋白〕、阴性对照组〔TG:(336.84±42.30)mg/g蛋白，TC：(343.41±34.45)mg/g蛋白〕、阴性对照抑制组〔TG:(348.93±31.11)mg/g蛋白，TC：(334.26±64.11)mg/g蛋白〕、转染试剂组〔TG:(347.17±36.47)mg/g蛋白，TC：(339.52±70.25)mg/g蛋白〕与正常对照组相比差异均无统计学意义(F=1.074，0.436，均P>0.05)。

3讨论

肝脏是脂代谢的重要器官，也是胰岛素作用的重要靶点，胰岛素可以促进脂质的合成和存储，促进脂肪酸进入细胞，增加脂质合成酶类的表达〔4〕，肝脏胰岛素抵抗是机体脂代谢紊乱的重要原因之一。

MicroRNA-126在内皮细胞及凋亡小体中含量非常丰富，影响血管新生、干细胞发育、细胞凋亡等〔5〕，但近年研究发现其与糖尿病的发生、发展也有着密切的联系，国内外研究表明糖尿病病人血浆中MicroRNA-126的含量较正常人群均降低〔3，6〕。前期实验发现MicroRNA-126可以明显减少人正常肝细胞中胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白的表达，而肝脏的胰岛素抵抗和胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2表达量减少相关，在糖尿病病人及动物模型中这两种蛋白的表达往往是下调的〔7，8〕，这些胰岛素信号的表达缺陷常导致糖脂代谢的异常。

在IRS/PI3K/AKT胰岛素信号传导通路中，胰岛素通过IRS-1激活了磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)，引起下游Akt及GSK-3等糖代谢酶类的激活〔4〕，这与之前的研究也相符，而细胞的脂代谢途径则是通过IRS-2调控脂肪合成相关酶类〔9〕，从而引起细胞脂代谢的变化。

通过本实验结果猜测MicroRNA-126对肝细胞脂代谢无影响。同时国外研究表明，单独抑制IRS-1的表达并不影响胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP1c)及Fasn等脂肪合成关键基因的表达，而IRS-2表达下降会引起Srebf1c表达上调，当同时抑制肝脏IRS-1和IRS-2，SREBP和Fasn的表达显著增加。同时抑制两种蛋白的小鼠肝脏中TG的含量较正常小鼠高出3倍以上，然而相比之下，抑制单一蛋白的小鼠肝脏中TG的增加量则不甚明显〔9〕。Bouzakri等〔10〕在人骨骼肌细胞中运用RNA干扰技术证明，在IRS-1蛋白表达下调的情况下，胰岛素刺激下的棕榈酸摄取量相较正常组没有明显改变，细胞的β氧化作用下降〔10〕。而IRS-2则是通过调控脂肪合成的酶类来维持脂质代谢的稳态，此结果也在敲除IRS-1和IRS-2的动物模型上得到验证〔11〕，与本实验结果相符。综合以上研究发现，IRS-1的功能和葡萄糖的稳态联系的更加密切，而IRS-2则更加密切联系于脂类代谢〔11〕，并且之前的研究发现，不同阶段T2DM患者循环MicroRNA-126水平和TC、TG含量并无相关性〔12〕。

综上所述，推测MicroRNA-126可能不是通过IRS-1/PI3K途经影响人正常肝细胞的脂代谢功能，其具体的分子作用机制还有待于进一步研究。

4参考文献

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10Bouzakri K，Zachrisson A，Al-Khalili L.siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle〔J〕.Cell Metabolism，2006;4(1)：89-96.

11Taniguchi CM，Emanuelli B，Kahn CR.Critical nodes in signa ling pathways：insights into insulin action〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2006;7(2):85-96.

12任彦红，黄婷，时学秀，等.循环miRNA-126在2型糖尿病患者中的表达变化及其相关性研究〔J〕.中国糖尿病杂志，2014;22(7)：663-6.

〔2014-02-17修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)