《回回药方》中扎里奴思方对动脉粥样硬化大鼠核因子-κB、单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

《回回药方》中扎里奴思方对动脉粥样硬化大鼠核因子-κB、单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

姜红李彦明徐胜东1刘敬霞

(宁夏医科大学，宁夏银川750004)

摘要〔〕目的研究扎里奴思方对动脉粥样硬化大鼠核因子(NF)-κB、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1表达的影响并探讨其作用机制。方法对照组喂以实验鼠SPF级颗粒饲料，实验鼠喂高脂饲料并以维生素D 315万U/kg 灌胃1次/w以建模。实验组分为模型组、辛伐他汀(0.003 g/kg)组、扎里奴思方高剂量组(3.08 g/0.1 kg)、扎里奴思方低剂量组(1.54 g/0.1 kg)。给药容积为1 ml/0.1 kg,1次/d。用药周期8 w，观察血脂代谢总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)及NF-κB、MCP-1等炎症因子在血管中的表达情况。结果血脂指标扎里奴思方高剂量组、低剂量组较空白组差异性明显(P<0.01)；MCP-1在辛伐他汀和扎里奴思方高剂量组阳性表达明显减少(P<0.05 or P<0.01)；对照组大鼠主动脉NF-κB表达较少(P<0.01)，模型组呈强阳性表达(P<0.05)，给药组呈中等阳性表达(P<0.01)。结论有效量扎里奴思方抑制体内的炎症因子表达可能为其对动脉粥样硬化有效的机制。

关键词〔〕扎里奴思方；动脉粥样硬化；NF-κB；MCP-1

中图分类号〔〕R29〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81260569)

通讯作者：刘敬霞(1970-)，女，博士，副教授，主要从事中医药、回医药防治老年病研究。

1济源市妇幼保健院

第一作者：姜红(1978-),女，硕士，讲师，主要从事中医学教学工作。

《回回药方》记载了多首芳香活血化瘀药方，扎里奴思方由安息香、法里公、法忒刺撒里荣、木里叶、撒法郎、牡丹皮、芦荟、伯思八牙、干祖伐、肉桂、腽肭脐、阿夫忒蒙、石菖蒲组成〔1〕。本课题组的研究〔2，3〕提示扎里奴思方具有减少动脉粥样硬化斑块，通过抑制血小板黏附和聚集来抗血栓形成,保护神经元、稳定动脉粥样硬化(AS)斑块等作用。慢性炎症反应是AS发生机制之一是多数学者的共识〔4，5〕。本课题组通过研究核因子(NF)-κB、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1在AS组织中表达的情况，进一步丰富扎里奴思方治疗AS的机制。

1材料与方法

1.1药物扎里奴思方组(安息香3 g、法里公12 g、法忒刺撒里荣12 g、木里叶12 g、撒法郎12 g、牡丹皮12 g、芦荟12 g、伯思八牙12 g、干祖伐24 g、肉桂12 g、腽肭脐12 g、阿夫忒蒙12 g、石菖蒲12 g)：将草药研末后待灌胃用，灌胃体积1 ml/0.1 kg。药材均来自宁夏医科大学附属回中医院。

1.2实验动物SD雄性大鼠，普通级，3月龄,60只，体重(300±50)g，均来自宁夏医科大学实验动物中心，均在同一动物房中饲养，饲养条件严格保证符合标准。常规喂养7 d。

1.3分组及给药空白对照组大鼠喂以SPF级实验鼠颗粒饲料。AS模型大鼠的制作方法改进版〔6〕：以配方为0.5%胆酸钠、3%胆固醇、0.12%丙硫氧嘧啶、10%猪油、5%白糖、81.38%基础饲料的高脂饲料喂养大鼠,每周灌胃315万U/kg维生素D 1次。造模开始6 w后随机处死3只大鼠检验造模情况,检测发现总胆固醇(TC)异常增高、 主动脉弹性下降、内膜增厚、肉眼可见脂质斑块,为造模成功。模型大鼠持续12 h禁食不禁水，眼眶取血检测血清中TC，根据TC随机分层将动物分为模型组、辛伐他汀组(0.003 g/kg)、扎里奴思方高剂量组(3.08 g/0.1 kg)、扎里奴思方低剂量组(1.54 g/0.1 kg)。按上述分组灌胃给药，给药容积为10 ml/kg,1次/d,连续给药8 w。

1.4血脂检测大鼠禁食不禁水12 h予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定，颈总动脉取血，静置离心分离血清，统一批号的试剂测定血清中TC、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及载脂蛋白(Apo)A1水平。

1.5血管组织中NF-κB、MCP-1的表达情况处死大鼠后剪取主动脉弓，4%多聚甲醛固定，做成厚度为4 μm的切片。继续行SABC法染色并测定大鼠主动脉弓NF-κB、MCP-1的表达情况，所用抗体为一抗羊抗鼠，二抗IGg。选6个随机光学视野观察：阴性(-，浅染淡蓝色)，弱阳性(+，有淡黄色颗粒物质)，中等阳性(，有黄色颗粒物质)，强阳性(，有棕黄色颗粒物质)。同一组标本中阳性表达评分，- = 0分；+=1分；=2分；=3分。

1.6统计学分析组间比较行t检验。

2结果

2.1扎里奴思方对AS大鼠血脂的影响模型大鼠血清中TC、LDL、HDL、AI明显升高较空白组差异显著(P<0.01)，给药组大鼠TC、LDL含量明显减少，AI降低，HDL略有升高，较模型组差异显著(P<0.05)。见表1。

2.2血管中MCP-1、NF-κB的表达情况大鼠主动脉中MCP-1无棕黄色颗粒出现；大量棕黄色颗粒出现在模型组主动脉内，呈强阳性表达，组间比较差异显著 (P<0.01)。MCP-1在辛伐他汀和扎里奴思方高剂量组阳性表达减少明显，低剂量组中阳性表达有所降低，与模型组比较差异不明显(P>0.05)。空白组大鼠主动脉NF-КB表达，少数细胞内出现淡黄色颗粒；模型组NF-КB表达呈棕黄色颗粒强阳性，扎里奴思方组NF-КB中等阳性表达，较模型组差异显著 (P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠血清中血脂含量及主动脉中NF-κB、MCP-1表达水平比较

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

3讨论

NF-κB为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：Rel (cRel)、p65 (RelA,NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。p65 、cRel和RelB分含有N端Rel同源区(RHD)和C端的反式激活结构域(TD)，在RHD的C末端有一个核定位区域(NLS)，负责与DNA结合、二聚体化和核易位，而TD则与转录活化相关。参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受NF-κB的调控，包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、环氧合酶(COX)2、趋化因子、黏附分子、集落刺激因子等，处于各种细胞因子网络调节的中心环节,活性调控非常复杂,激活后可与EC上黏附分子、IL-6、IL-1、IL-8、MCP-1等基因增强子序列中相应结合位点结合,迅速诱导其基因表达，使表达增强〔7〕。MCP-1作为一种趋化因子，在炎症反应中具有重要作用，编码MCP-1基因的表达受NF-κB的调控，单核细胞中存在着NF-κB的信号通路，是单核细胞增殖时必经的信号通路。《回回药方》记载了多首芳香活血化瘀药方，扎里奴思方由安息香、法里公、法忒刺撒里荣、木里叶、撒法郎、牡丹皮、芦荟、伯思八牙、干祖伐、肉桂、腽肭脐、阿夫忒蒙、石菖蒲组成。有关扎里奴思方对减少AS斑块、治疗动脉粥样硬化性脑血管病方面的研究较多，其稳定AS斑块作用基本明确，有临床和实验研究证实。本课题组发现扎里奴思方可以改善模型大鼠血脂紊乱现象,降低TC、LDL、ApoA1，增加HDL,具有良好的治疗效果。扎里奴思方能下调EC中MCP-1的表达，对NF-κB有抑制其表达的趋势。表明扎里奴思方可以通过抑制MCP-1及NF-κB的表达，减轻EC的损伤。

4参考文献

1牛阳.回回药方研究〔M〕.银川:黄河出版传媒集团阳光出版社，2010：238.

2单晓宇.回药扎里奴思方对脑梗死患者颈动脉硬化的影响〔J〕.宁夏医科大学学报，2010;34(8)：753-6.

3刘敬霞，李建生.扎里奴思方和蜜煎菖蒲方对脑缺血大鼠血栓形成和血小板聚集的影响〔J〕.宁夏医科大学学报,33(12)：1117-9.

4徐也鲁.动脉粥样硬化——一种慢性炎症过程〔J〕.中国动脉硬化杂志,2001;9(2):93-5.

5Ross R.Atherosclerosisan inflammatory disease〔J〕.J N Engl Med,1999;340:115-26.

6杨晓玲,赵迅霞,王菲,等.实验大鼠动脉粥样硬化模型的建立〔J〕.宁夏医学院学报,2007;8(29):350-2.

7Monaco C,Andreakos E,Kiriakidis S,etal.Canonical pathway ofnu-clear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and pro-thrombotic responses in human atherosclerosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2004;101(15):5634-9.

〔2014-09-11修回〕

(编辑曲莉)