基于p38MAPK通路探讨疏肝健脾方药含药血清对LPS刺激下大鼠Kupffer细胞炎症损伤保护作用的机制

基于p38MAPK通路探讨疏肝健脾方药含药血清对LPS刺激下大鼠Kupffer细胞炎症损伤保护作用的机制

韩莉李媛媛1杨钦河1张玉佩1梁荫基1李树成龚享文王观龙1张金文1林春梅1金玲王攀攀

(暨南大学附属第一医院，广东广州510632)

摘要〔〕目的基于p38MAPK通路探讨疏肝健脾方药含药血清对脂多糖(LPS)刺激大鼠Kupffer细胞炎症损伤的保护作用。方法体外培养并鉴定SD大鼠Kupffer细胞，提取并制备疏肝健脾方药含药血清，在LPS刺激大鼠Kupffer细胞产生炎症反应基础上，对Kupffer细胞进行疏肝健脾方药含药血清、p38MAPK抑制剂药物干预，ELISA法检测Kupffer细胞上清液中白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量的表达，Western印迹检测Kupffer细胞 TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达。结果疏肝健脾方药含药血清提取量约为每只2～3 ml，大鼠获得纯化并经免疫荧光法鉴定Kupffer细胞(0.5～1.0)×107个,Typan blue染色测定细胞活力均在95%以上；LPS组较空白血清组IL-6、TNF-α水平均有显著升高(P<0.01)；与LPS组比较，各药物干预组IL-6、TNF-α表达水平显著降低(P<0.01)；与空白血清组比较，LPS组的p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表达均有显著升高(P<0.01)；与LPS组比较，SB239063能显著下调p38MAPK的蛋白表达水平(P<0.01)，肝健脾组亦有下调，但无显著差异(P>0.05)；疏肝健脾组、SB239063组的p-p38MAPK蛋白表达水平均下调显著(P<0.01)；TLR4蛋白表达水平以疏肝健脾组下调具有显著性差异(P<0.01)，SB239063组下调无显著差异(P>0.05)。结论疏肝健脾方药可能对LPS刺激大鼠Kupffer细胞炎症损伤发挥保护作用,而含药血清可能是其重要作用途径之一。

关键词〔〕疏肝健脾方药；p38MAPK；Kupffer细胞；炎症损伤

中图分类号〔〕R28〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：杨钦河(1961-)，男，医学博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事中西医结合肝病研究。

1暨南大学医学院

第一作者：韩莉(1963-)，女，医学硕士，副主任医师，主要从事中西医结合肝病基础与临床研究。

Based on p38MAPK pathway investigate the effects of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum on LPS-stimulated inflammatory injury in Kupffer cells of rats

HAN Li,LI Yuan-Yuan,YANG Qin-He,etal.

The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the protective mechanism of the soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum on the Kupffer cells (KCs) of the inflammatory injured rats based on p38 mitogen activated protein kinases (p38MAPK) pathway.MethodsThirty SD rats were randomly divided into normal control,soothing liver and invigoration spleen recipes treatment(SGJP) and KCs extraction groups.After isolation,cultivating and identifying KCs of SD rats,at the same time,soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum was made up.KCs of rats with inflammation under LPS stimulation were interfered by normal serum,soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum and p38MAPK inhibitor drug (SB239063) respectively.The expressions of interleukin(IL)-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) levels on KCs supernatant were tested by ELISA,while the expressions of KCs toll-like receptor(TLR)4,p38MAPK and P-P38 mitogen-activated protein kinase (p-p38MAPK) were detected by Western blot.ResultsThe extracting volume of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum of each rats was about 2～3 ml (per rats).Purifying and identifying KCs through immunofluorescence assay,(0.5～1.0)×107 units of KCs were ascertained.Both IL-6 and TNF-α levels in LPS group were significantly elevated more than those of normal serum group(P<0.01).Compared with those of LPS group,IL-6 and TNF-α expression levels of the drug intervention group were significantly decreased (P<0.01).Compared with those of normal serum group,protein expressions of TLR4,p38MAPK,p-p38MAPK in LPS group were significantly increased (P<0.01).Compared with that of LPS group,TLR4 protein expression level in SGJP group had a significant difference (P<0.01).The p-p38MAPK protein expression level of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum and SB239063 groups were significantly down-regulated (P<0.01).ConclusionsSoothing liver and invigorating spleen recipes contained serum might have protective effects on the LPS-stimulated inflammatory injury in KCs of rats and contained serum might be one of important pathways of soothing liver and invigorating spleen recipes treating NASH.

【Key words】Soothing liver and invigorating spleen recipes；p38MAPK pathway；Kupffer cells；Inflammatory injury

研究表明，肠源性毒素通过血液循环进入肝脏后，能够调控Kupffer细胞活性和细胞因子的产生；同时，肠道细菌定性和定量的变化导致肠道通透性增高和肠道内毒素易位，也会解酒精个生月解方生肝炎诱导肝脏多种炎性细胞的转录基因及细胞因子的激活〔1，2〕。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌外膜，是肠道细菌内毒素最重要的组成部分，能够诱导活化肝脏Kupffer细胞，通过调节某些炎症通路，触发细胞因子〔肿瘤坏死因子(TNF)-α等〕的释放，从而产生炎症反应〔3,4〕。本课题组前期研究表明，中药复方疏肝健脾方药能够作用于解酒精生脂肪生肝炎(NASH)大鼠肝细胞p38MAPK通路，抑制白介素(IL)-1、IL-6、TNF-α发挥抗炎作用，对解酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝脏p38MAPK蛋白表达也有明显抑制作用〔5，6〕。本研究在建立LPS刺激下大鼠Kupffer 细胞炎症损伤细胞模型基础上，观察疏肝健脾方药含药血清通过p38MAPK信号通路对LPS刺激下大鼠Kupffer 细胞炎症损伤体外模型的保护作用。

1材料与方法

1.1药物疏肝健脾方药为柴胡疏肝散和参苓白术散的合方，柴胡疏肝散：柴胡6 g，白芍5 g，枳壳5 g，川芎5 g，陈皮6 g，香附5 g，炙甘草3 g。参苓白术散：人参15 g，茯苓15 g，白术15 g，白扁豆12 g，莲子9 g，山药15 g，砂仁6 g，薏苡仁9 g，桔梗6 g，炙甘草9 g。以上药物均为深圳华润三九医药股份有限公司提供的中药配方颗粒剂，购自暨南大学附属第一医院中药房。

1.2动物及分组SPF级SD大鼠30只，体重(200±20)g，雌雄各半，暨南大学动物实验管理中心提供，动物许可证号：SYXK(粤)2012-0117。大鼠按随机数字表法分为正常组、疏肝健脾方药组，Kupffer细胞提取组。3组，每组10只，正常组给予等体积生理盐水，疏肝健脾方药组根据李仪奎等〔7〕提出的制备含药血清的给药方法，给药剂量=在体实验的给药剂量×反应系统中被稀释的倍数，在体实验的给药剂量根据本课题组前期的研究结果定为11.9 g/kg〔8〕。因在下一步的细胞体外培养系统中将加入20%的血清，疏肝健脾含药血清组剂量为59.5 g/kg。

1.3试剂与仪器Ⅳ型胶原酶(美国Gbico公司)；胎牛血清(德国Hyclone公司)；兔多克隆抗CK18、ED1、山羊抗兔IgG(H+L),FITC conjugated(镇江厚普生物科技有限公司)；LPS、SB239063(美国Sigma公司)；IL-6、TNF-α双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；抗p38 MAPK、抗磷酸化(P)p38MAPK(美国CST公司)；抗TLR4(英国Abcam公司)；CO2细胞培养箱、酶联免疫检测仪(美国Thermo Scientific公司)；Mini-sub CELLgT电泳仪、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.4含药血清的制备SD大鼠均饲养于暨南大学动物实验管理中心SPF级实验室，给药前常规喂养7 d。第8天起开始灌胃给药，每天2次，12 h一次，连续3 d。腹主动脉采血，分离血清，并进行热灭活处理。最后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，冰冻保存备用。

1.5Kupffer细胞提取采用离体循环灌注Ⅳ型胶原酶消化后提取Kupffer细胞，具体方法参照本课题组论文〔9〕，分离后所获Kupffer细胞接种于细胞培养瓶，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。

1.6LPS刺激肝细胞炎症损伤及药物干预用LPS(40 mg/L)刺激在体外培养的Kupffer细胞，并分别用p38MAPK信号通路阻断剂SB239063(2 mg/L)、20%疏肝健脾含药血清予以干预，用20%空白血清(空白血清组)作为对照。

1.7指标检测

1.7.1Kupffer细胞形态、状态及鉴定Typan blue染色后进行细胞计数，观察各组细胞状态，通过免疫荧光对Kupffer细胞进行鉴定。

1.7.2ELISA法检测Kupffer细胞上清液中IL-6、TNF-α含量当大鼠Kupffer细胞在96孔细胞培养板上贴壁生长、状态良好、每孔细胞数量不少于1×104个时，加入不含血清的DMEM/F12基础培养基，然后再按各组药物干预方案添加药物至目标浓度后，放回细胞培养箱中培养24 h后，吸取细胞上清，保存备用。用ELISA方法检测Kupffer细胞上清液中TNF-α、IL-6 的质量浓度，具体操作严格按照说明书进行。

1.7.3Western印迹法检测大鼠Kupffer细胞p38MAPK相关通路蛋白表达水平取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mmol/L。按照(5～10)×106个Kupffer细胞加入1 ml RIPA裂解液,4℃，10 000～14 000 r/min离心5～10 min，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。根据碧云天BCA蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定。Kupffer细胞样本进行凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、4℃过夜。洗涤后加入二抗，孵育，充分洗涤，然后进行化学发光。曝光、 显影、 定影,最后对结果进行光密度扫描分析 。

2结果

2.1细胞数量每只大鼠可获得纯化后的肝Kupffer细胞数量为(0.5～1.0)×107个，细胞活力均在95%以上。

2.2细胞形态及免疫荧光鉴定刚提取出的Kupffer细胞呈圆点形状,一般15 min左右开始贴壁，3 h后基本完全贴壁，细胞呈梭形，部分有伪足。ED1免疫荧光鉴定，可见梭形的Kupffer细胞呈绿色荧光，即Kupffer细胞呈ED1阳性表达。见图1。

Kupffer细胞

Kupffer细胞免疫荧光鉴定

2.3Kupffer细胞状态空白血清组Kupffer细胞贴壁生长，少见细胞脱落，细胞多有伪足，呈健康的梭形细胞形态。LPS组可见大量细胞脱落或细胞挛缩成小圆点，贴壁细胞极少，细胞核不可见，伪足基本全部消失。见图2。

2.4ELISA法检测Kupffer细胞上清液中IL-6、TNF-α含量与空白血清组比较，LPS组中IL-6、TNF-α水平均显著升高(P<0.01)。与LPS组比较，各药物干预组IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.01)。见表1。

2.5Western印迹法检测大鼠肝细胞p38MAPK相关通路蛋白表达水平与空白血清组比较，LPS组p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表达均显著升高(P<0.01，P<0.05)；与LPS组比较，SB239063组均能显著下调上述蛋白表达水平(P<0.01)；疏肝健脾组亦能下调p38MAPK的蛋白表达水平，但无显著差异(P>0.05)，疏肝健脾组、SB239063组p-p38MAPK的蛋白表达水平均下调显著(P<0.01)，TLR4蛋白表达水平以疏肝健脾组下调最显著(P<0.01)；SB239063组亦能下调TLR4蛋白表达水平，但无显著差异(P>0.05)，见表2，图2。

表1　大鼠Kupffer细胞IL-6、TNF-α表达

与空白血清组比较：1)P<0.05；与LPS组比较：2)P<0.01

表2　大鼠肝细胞p38MAPK信号通路相关

与空白血清组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与LPS组比较：3)P<0.01

图2　Kupffer细胞p38MAPK、 p-p38MAPK、TLR4蛋白灰度值比较

3讨论

Kupffer细胞被认为是肠-肝轴的第一道反应程序，体内研究表明，肠源性内毒素LPS能够通过刺激肝Kupffer细胞导致IL-6、TNF-α等炎症介质的释放，导致肝组织损伤，加重NASH的发展演变〔10,11〕。本次体外研究表明LPS能够刺激Kupffer细胞产生TNF-α、IL-6炎症介质，与体内实验结果相符。这种体内外研究的一致性，为NASH发病机制体外研究提供了基础。

LPS刺激Kupffer细胞导致炎症介质释放增加，在单纯脂肪性肝病变向NASH的发展演变发挥了重要作用。TLR4是p38MAPK的上游通路，LPS是TLR4的最重要的配体，由LPS与TLR4相结合，通过系列级联反应，启动TLR4介导的信号通路。在通过MYD88依赖反应通路，激活TRAF-6，并与接头蛋白TAB-1相结合，再激活TAK-1。TAK-1是TLRS通路和MAPKS的连接纽带。因此，TLR4最终激活p38MAPK的活化，同时p38MAPK的活化又与IL-6、TNF-α、IL-10等炎症因子的表达密切相关〔12～14〕。本研究表明，LPS组中LPS刺激Kupffer细胞TLR蛋白表达明显增加，激活导致p38MAPK蛋白表达及磷酸化。提示p38MAPK信号通路可能是LPS刺激Kupffer细胞IL-6、TNF-α炎症介质表达明显增加重要通路。

疏肝健脾方是古代名方柴胡疏肝散和参苓白术散组合方而成，二者主要活性成分包括阿魏酸、人参皂苷、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、芍药内酯苷和白术苷等。其中柚皮苷、橙皮苷和阿魏酸等活性成分被证实具有一定的抗炎作用。前期体内实验研究表明，疏肝健脾方药具有通过调控Kupffer细胞，使p38MAPK信号通路相关蛋白表达及活化，减少炎症介质(IL-6、TNF-α)的释放，最终达到减轻炎症损伤的效果〔5，6〕。将含药血清用于体外细胞培养是中药复方研究的重要方向，药物将受试药物经口给予动物后，取其血清作为药物源加入离体反应系统中研究其药理作用，比较接近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程，其原有成分或在体内转化为活性成分，或代谢后失活，或没有被吸收入体内，或通过第二信使而间接起作用都可以通过血清药理学反映出来，理论上更具备科学性、真实性〔15〕。本次研究应用从SD大鼠中提取并制备的疏肝健脾方药含药血清，并将含药血清对LPS刺激大鼠体外Kupffer细胞造成的炎症损伤进行干预结果提示含药血清调控Kupffer细胞p38MAPK信号通路相关蛋白表达及活化，减少炎症介质(IL-6、TNF-α)的释放，这与体内试验的研究结果具有一致性。药物吸收入血可能是疏肝健脾方药作用于Kupffer细胞p38MAPK信号通路相关蛋白表达及活化，减少炎症介质(IL-6、TNF-α)的释放，最终达到减轻炎症损伤的重要作用途径。有研究表明〔16,17〕参苓白术散及柴胡疏肝散具有调节肠道菌群失衡及杀菌抗炎的效果，而LPS作为是细菌内毒素最重要的组成部分，在NASH的发生发展中发挥了重要的作用。疏肝健脾方药是否能够通过调节肠道微生态环境而减少内毒素LPS产生有待进一步研究。

4参考文献

1Nagata K,Suzuki H,Sakaguchi S.Common pathogenic mechanism in development progression of liver injury caused by non-alcoholic or alcoholic steatohepatitis〔J〕.J Toxicol Sci,2007;32(5):453-68.

2Vajro P,Paolella G,Poeta M,etal.Pediatric non alcoholic fatty liver disease:more on novel treatment targets〔J〕.BMC Pediatrics,2013;13(1):109.

3Shanab AA,Scully P,Crosbie O,etal.Small intestinal bacterial overgrowth in nonalcoholic steatohepatitis:association with toll-like receptor 4 expression and plasma levels of interleukin 8〔J〕.Digest Dis Sci,2011;56(5):1524-34.

4Bilzer M,Roggel F,Gerbes AL.Role of kupffer cells in host defense and liver disease〔J〕.Liver Int,2006;26(10):1175-86.

5Yang QH,Xu YJ,Feng GF,etal.p38 Mapk signal pathway involved in anti-inflammatory effect of chaihu-shugan-san and shen-ling-bai-zhu-san on hepatocyte in non-alcoholic steatohepatitis rats〔J〕.Afr J Tradit Complem,2013;11(1):213-21.

6杨钦河,谢芳,王凤珍,等.不同治法方药对脂肪肝大鼠肝组织 NF-κBp65 及〔J〕.广州中医药大学学报,2009;27(2):141.

7李仪奎.中药血清药理学实验方法的若干问题〔J〕.中药新药与临床药理,1999;(2):31-4.

8韩莉,杨钦河,杨雪松,等.疏肝健脾方药对 NASH 大鼠 Kupffer 细胞 NF-κB p65 和 IKKβ mRNA 及蛋白表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志,2013;29(4):641-6.

9冯高飞,杨钦河,王文晶,等.非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝细胞和库普弗细胞同时分离及鉴定〔J〕.广东医学,2012;33(1):40-3.

10Kudo H,Takahara T,Yata Y,etal.Lipopolysaccharide triggered TNF-α-induced hepatocyte apoptosis in a murine non-alcoholic steatohepatitis model〔J〕.J Hepatol,2009;51(1):168-75.

11Gäbele E,Dostert K,Hofmann C,etal.DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in Experimental NASH〔J〕.J Hepatol,2011;55(6):1391-9.

12Yang L,Seki E.Toll-like receptors in liver fibrosis:cellular crosstalk and mechanisms〔J〕.Front Physiol,2012;3(1):1-18.

13Agrawal S,Gollapudi S,Su H,etal.Leptin activates human B cells to secrete TNF-α,IL-6,and IL-10 via JAK2/STAT3 and p38MAPK/ERK1/2 signaling pathway〔J〕.J Clin Immunol，2011;31(3):472-8.

14Park EJ,Lee JH,Yu GY,etal.Dietary and genetic obesity promote liver inflammation and tumorigenesis by enhancing IL-6 and TNF expression〔J〕.Cell,2010;140(2):197-208.

15杨萃.中药复方在体外实验的研究进展〔J〕.光明中医,2013;28(10):2229-31.

16舒青龙,徐刚,叶荷平,等.参苓白术散对体外艰难梭菌生长的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2013;19(2):258-62.

17彭颖,李晓波,彭颖.脾虚证与肠道微生态〔J〕.世界华人消化杂志,2012;20(34):3287-91.

〔2014-05-17修回〕

(编辑李相军)