香烟烟雾提取物对Ⅱ型肺泡上皮细胞中Derlin-1表达的影响

香烟烟雾提取物对Ⅱ型肺泡上皮细胞中Derlin-1表达的影响

彭艳胡瑞成1

(长沙市第一医院呼吸科，湖南长沙410000)

摘要〔〕目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)对Ⅱ型肺泡上皮细胞中Derlin-1蛋白及其mRNA表达的影响。方法体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)，加入10%浓度的CES作用于细胞0、3、6、12、24、48 h，采用免疫蛋白印迹(WB)检测Derlin-1蛋白表达水平的变化，并运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Derlin-1 mRNA含量的变化。结果10%浓度的CSE作用下，Derlin-1蛋白的表达逐渐提高，并在6 h达最高，随后逐渐下降，Derlin-1 mRNA含量变化与Derlin-1蛋白表达一致。结论香烟烟雾可影响Ⅱ型肺泡上皮细胞中Derlin-1表达的变化，可能与Derlin-1是内质网应激诱导凋亡的抑制剂有关。

关键词〔〕香烟烟雾提取物；Ⅱ型肺泡上皮细胞；Derlin-1； 内质网应激

中图分类号〔〕R3〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81070035)；湖南省科技计划项目(No.2009JT3054)；湖南省医药卫生科研项目(No.B2008-026)

通讯作者：胡瑞成(1973-)，男，博士，主任医师，主要从事呼吸系统疾病研究。

Effect of cigarette smoke extract on the expressional levels of Derlin-1 in alveolar type Ⅱ cells

PENG Yan, HU Rui-Cheng.

Department of Respiratory,the First Hospital of Changsha City,Changsha 410000,Hunan,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of cigarette smoke extract(CSE) on expressional levels of Derlin-1 protein and mRNA in the cultured A549 cells those were rat alveolar typeⅡ cells lines. MethodsWestern blot was used to detect the level of Derlin-1 protein expression exposured to 10% concentration of CSE at different time (0,3,6,12,24,48 h). RT-PCR was used to measure the change of Derlin-1 mRNA. ResultsIn 10% concentration of CSE, Derlin-1 protein expression gradually was increased and reached the highest at 6 h and then decreased gradually. RT-PCR results consistented with the result of Western blot. ConclusionsCigarette smoke can affect the changes of the expression of Derlin-1 in alveolar typeⅡ cells, which may be associated with that Derlin-1 is the apoptosis inhibitor of endoplasmic reticulum stress.

【Key words】Cigarette smoke extract; Alveolar epithelial cells; Derlin-1; Endoplasmic reticulum stress

1湖南省老年医院-湖南省老年医学研究所呼吸疾病研究室

第一作者：彭艳(1984-)，女，硕士，医师，主要从事呼吸系统疾病研究。

吸烟是引起慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要的危险因素之一。近年来研究表明香烟烟雾中的氧化物质可导致肺结构细胞发生内质网应激，加速肺组织损伤和肺功能减退，从而促进COPD的发生发展〔1，2〕。Derlin-1也称内质网相关降解蛋白1，是位于内质网的跨膜蛋白，其与内质网相关降解有密切关系〔3，4〕。Derlin-1具有缓解内质网应激的作用。但是，目前对Derlin-1在COPD中的作用缺乏研究。Ⅱ型肺泡上皮细胞功能状态是决定肺损伤病理转归的主要因素，在COPD发病中起重要作用〔5〕。本研究探讨香烟烟雾提取物(CSE)对Ⅱ型肺泡上皮细胞中Derlin-1表达的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器A549细胞(本实验室保存)，芙蓉牌香烟(湖南中烟工业有限责任公司，尼古丁1.0 mg/支，焦油12 mg/支)；胎牛血清、DMEM购自Gibco公司；反转录试剂盒、Trizol Reagent、Derlin-1和β-actin引物均来自Invitrogen公司；PCR试剂盒(PCR Master Mix)购于Fermentas公司；DNA Marker 2000购自TaKaRa；总蛋白提取试剂盒(强裂解液和蛋白酶抑制剂)，Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物研究所；抗Derlin-1抗体(SANTA公司)，β-actin(武汉博士德)；辣根过氧化物酶标记的二抗(抗兔IgG与抗鼠IgG 北京中杉公司)；ECL底物发光试剂盒购自Thermo公司；低温高速离心机为美国Beckman公司；普通PCR扩增仪为ABI9600；水平电泳仪(北京六一仪器公司)；紫外分光光度计(上海江仪)；凝胶成像分析系统为中国北京天能，TannonGis-2010型；垂直电泳仪为BIO-RAO公司产品。

1.2方法

1.2.1CSE的制备参照文献〔6〕的方法，取两支去过滤嘴香烟，通过改造的20 ml注射器抽把烟雾抽入50 ml不含血清的DMEM中，用1 mol/L的NaOH调pH为7.4，用0.22 μm孔径的孔滤膜过滤，所得溶液在30 min内用于后续实验。

1.2.2细胞培养A549细胞在含10%胎牛血清(10%FBS)、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养液中培养，在37℃含5%的CO2培养箱中传代至第3代在6孔板中调整细胞密度至4×105～5×105，用无血清DMEM漂洗2次后，加入10%浓度的CSE进行刺激，分别培养0，3，6，12，24，48 h，收集细胞用于后续Western印迹法和PCR检测。

1.2.3Western印迹检测各组细胞中Derlin-1蛋白的表达收集细胞，加入适量预冷的蛋白裂解液，冰上裂解细胞，Bradford法检测所提蛋白浓度，取30 μg总蛋白样品液上样，进行SDS-PAGE转膜，用Derlin-1 (1∶200)、β-actin (1∶1 000)、辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(1∶2 000)，最后用ECL将我发光试剂显色，扫描胶片并用Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件分析条带的灰度值，重复实验3次。

1.2.4 RT-PCR检测各组细胞Derlin-1 mRNA的表达收集各组细胞约106～107按说明书加1 ml Trizol试剂裂解细胞，再用氯仿抽提，异丙醇和75%乙醇洗涤沉淀，用无Rnase的双蒸水溶解RNA，采用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度；以所提RNA为模板按逆转录试剂盒说明合成互补脱氧核糖核酸(cDNA),以cDNA作为模板进行聚合酶链式反应；Derlin-1上游引物：5′-GCTCATTGGAAACCTTGTCG -3′，下游引物：5′- CCACCTCCGCCATTCTGAT -3′，扩增产物为：195 bp，退火温度：55℃；β-actin 上游引物：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGT-3′，下游引物：5′-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3′,扩增产物为295 bp，退火温度：61.5℃。PCR反应条件：94℃预变性3 min,94℃变性30 s，反应完成后72℃延伸5 min。扩增产物10 μl经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统扫描后，Gel pro4.0版凝胶光密度分析软件分析扩增产物条带，分别测定各扩增带吸光度值，将目的基因与内参照β-actin扩增带的吸光度比值作为其mRNA相对表达水平，重复实验3次。

1.3统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

2结果

2.1各组细胞中Derlin-1蛋白的表达大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在10%浓度CES刺激下，Derlin-1蛋白表达先增高后降低，6 h表达最高(P<0.05)，见表1、图1。

组别Derlin-1蛋白Derlin-1mRNA0h组12.34±0.692.20±0.103h组15.41±1.181)4.07±0.151)6h组22.26±3.021)2)6.13±0.811)2)12h组18.90±1.581)2)3)3.83±0.211)3)24h组16.95±1.361)3)3.63±0.311)3)48h组14.66±2.373)4)3.10±0.101)2)3)4)F/P值16.82/0.0037.11/0.00

与0 h比较：1)P<0.05；与3 h比较：2)P<0.05；与6 h比较：3)P<0.05；与12 h比较：4)P<0.05

图1　10%CSE对A549细胞中Derlin-1蛋白表达的影响

2.2Derlin-1 mRNA在各组细胞中的表达用浓度10%的CSE刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞，Derlin-1 mRNA先增高后降低，6 h达最高(P<0.05)，见表1，图2。

图2　10%CSE浓度对A549细胞中Derlin-1 mRNA表达的影响

3讨论

Derlin-1是内质网上的跨膜蛋白，主要分布于细胞内质网中，由4个跨膜区域组成，其氨基端与羧基端均存在于胞液中〔7～9〕。错误折叠或者未折叠蛋白在内质网中堆积引发内质网应激。持续或者严重的内质网应激导致细胞凋亡。研究发现错误折叠蛋白通过Derlin-1从内质网中跨膜转运到胞质中，随后被蛋白酶体所降解，从而缓解内质网应激〔10〕。因此Derlin-1是内质网诱导凋亡的抑制剂，介导内质网相关降解〔11，12〕。香烟烟雾中的有害成分可导致内质网应激〔13〕。本研究表明在10%CSE作用下，Ⅱ型肺泡上皮细胞中Derlin-1蛋白的表达先增高后降低，6 h达最高，在时间上有一定的依赖性。本实验室前期研究表明，香烟烟雾可导致大鼠COPD，并与内质网应激有直接的关系〔14〕。因此，Derlin-1可能参与香烟烟雾导致COPD的发病过程中，然而其具体的机制还有待进一步研究。

4参考文献

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〔2012-12-12修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)