组织因子途径抑制物－2在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响

组织因子途径抑制物-2在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响

孟斐

(沈阳医学院附属中心医院妇产科，辽宁沈阳110024)

摘要〔〕目的观察组织因子途径抑制物(TFPI)-2在正常宫颈、宫颈上皮内肿瘤(CIN)和宫颈鳞癌组织中表达的差异及TFPI-2对体外培养的宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响。方法收集2009～2010年在该院妇产科住院治疗的68例宫颈鳞癌患者，48例CIN患者及12例宫颈正常患者的宫颈组织标本，免疫组化染色检测宫颈组织中TFPI-2的表达。取生长状态良好的宫颈癌Hela细胞，应用基因转染的方法建立TFPI-2高表达细胞系，Real-time PCR和Western印迹方法检测基因转染前后细胞中TFPI-2 mRNA和蛋白的表达；四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测各组细胞的增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果①免疫组化染色显示，正常宫颈组织、CIN和宫颈癌中TFPI-2表达逐渐降低，三者间比较差异有统计学意义 (P<0.01)。②体外观察发现，转染pcDNA3.1-TFPI-2的Hela-TFPI-2组细胞TFPI-2 mRNA和蛋白表达明显高于转染空白质粒组和空白对照组(P<0.01)；MTT结果显示，Hela-TFPI-2组细胞增殖速度明显低于空白对照组和空白质粒组，且随着培养时间的延长，这种抑制作用更明显(P<0.05)；流式细胞仪检测结果显示Hela-TFPI-2组细胞凋亡率显著高于空白对照组和空白质粒组(P<0.05)。结论TFPI-2表达随着宫颈病变的进展逐渐降低；同时过表达的TFPI-2可明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖，促进其凋亡。提示TFPI-2的表达减少可能是宫颈癌发生发展的机制之一，TFPI-2可能是治疗宫颈癌的新靶点。

关键词〔〕宫颈癌；组织因子途径抑制物-2；Hela细胞；细胞增殖；凋亡

中图分类号〔〕R73〔

第一作者：孟斐(1972-),女，博士，主任医师，主要从事宫颈疾病研究。

组织因子途径抑制物(TFPI)-2具有抑制肿瘤侵袭和转移的作用〔1〕。研究〔2～4〕发现，在许多类型的人类肿瘤细胞中，都存在编码TFPI-2基因的抑制及缺失。目前国内外关于TFPI-2在宫颈癌中的研究并不多见，有研究〔5〕显示，TFPI-2失活可能与宫颈癌细胞的增殖和凋亡有关，但是目前尚缺乏相关报道。本研究分别通过体内和体外实验观察TFPI-2在正常宫颈、宫颈上皮内肿瘤(CIN)和宫颈鳞癌组织中表达的差异，及TFPI-2对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响。探讨TFPI-2在宫颈癌发生、发展过程中的作用，为寻找新的抗肿瘤治疗方法提供思路，为宫颈癌的基因治疗寻找新的靶点。

1资料和方法

1.1材料纳入2009～2010年在我院妇产科住院治疗的患者。其中宫颈鳞癌患者68例，年龄22～71〔平均(43±6)〕岁；CIN患者48例，年龄25～69〔平均(45±5)〕岁；宫颈正常患者12例，为子宫肌瘤患者切除肌瘤时的正常宫颈组织，年龄34～62〔平均(42±3)〕岁。所有患者在取材前均未经放化疗及生物和手术治疗，均经病理诊断证实，排除宫颈腺癌患者。各组患者年龄无统计学差异。均签署知情同意书。人宫颈癌Hela细胞购自中科院上海细胞研究所。37℃温水浴复苏，高糖DMEM培养基(Hyclon公司)中培养，待细胞长满80%以上进行传代，取第3代对数生长期细胞进行实验。

1.2方法

1.2.1免疫组化染色检测宫颈组织TFPI-2的表达取宫颈组织，40 g/L多聚甲醛固定后，脱水，浸蜡，包埋，行4 μm厚连续切片，切片常规脱蜡，二甲苯透明，梯度乙醇水化后热修复抗原；磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，3%过氧化氢37℃孵育20 min，阻断内源性过氧化物酶；PBS冲洗，山羊血清封闭。在兔抗人TFPI-2多克隆抗体(1∶160；北京博奥森生物技术有限公司)中4℃孵育过夜；PBS冲洗后生物素标记二抗工作液(北京中山金桥生物技术公司)中37℃孵育15 min；PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，二氨基联苯胺(DAB)显色(北京中山金桥生物技术公司)，显微镜(日本Olympus公司)下控制染色程度，蒸馏水洗涤终止反应，苏木精复染，自来水冲洗，返蓝；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。用PBS代替一抗作为阴性对照。由两名病理科医师进行盲法阅片，在200倍镜下随机选取5个视野进行判读，细胞质出现棕黄色可以为TFPI-2表达阳性。其中阳性表达75%～100%为强阳性()，50%～75%为次强阳性()，10%～50%为阳性()，<10%为弱阳性(+)，不表达为阴性(-)。

1.2.2细胞转染目的基因pcDNA3.1-TFPI-2质粒和空白pcDNA3.1质粒均由上海吉凯基因化学有限公司合成。参照Lipofectamine2000试剂盒说明书进行转染。取对数生长期Hela细胞，胰酶消化，含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，按1×105个细胞接种至培养板，待细胞70%～80%融合后，加入1∶1的脂质体/质粒混合液进行转染。Hela-TFPI-2组转染pcDNA3.1-TFPI-2质粒，空白质粒组转染pcDNA3.1 空白质粒，空白对照组不进行转染。48 h后G418进行抗性筛选，用于Real-time PCR和Western印迹检测。

1.2.3Real-time PCR检测转染后的宫颈癌细胞Hela中TFPI-2 mRNA的表达按Trizol试剂说明提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA完整性和纯度，利用cDNA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据Gen-Bank的人TFPI-2 mRNA序列，以primer5.0设计其上、下游引物序列，由大连宝生物公司合成。Real-time PCR反应体系共20 μl，2×Real-time PCR Master Mix(SYBR Green) 10 μl，模板(cDNA稀释10倍)2 μl，上、下游引物各0.4 μl (10 μmol/L)，ddH2O 7.2 μl。反应条件：95℃，预变性30 s。95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环。应用Rotor-Gene 3000荧光实时定量PCR仪的Comparative Delta-delta Ct法对获得的荧光曲线结果进行分析，结果用2-ΔΔCt表示，以DAPDH作为内参。

1.2.4Western印迹法检测转染后的宫颈癌细胞Hela中TFPI-2蛋白的表达取各组组织，用细胞裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)方法测蛋白浓度；调节蛋白浓度一致，取等量蛋白样品，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，然后用半干式电转的方法将蛋白质转移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，封闭液室温封闭2 h，1∶200稀释的兔抗人TFPI-2多克隆抗体室温杂交2 h；1∶3 000稀释的生物素标记的羊抗兔IgG室温杂交2 h，电化学发光法(ECL)发光，曝光、显影、定影。应用北京航天航空大学CM-2000B型生物医学图像分析系统测量条带的吸光度值，以β-actin作为内参。

1.2.5四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测转染后的宫颈癌细胞Hela增殖情况分别于转染后24、48、72 h以0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化为单细胞悬液后，按照103～104/孔接种于包被过的多聚赖氨酸的96孔板中，0.2 ml/孔，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续培养4 h后终止培养，弃上清，然后每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min，于酶免分析仪490 nm测定吸光度(A)值。

1.2.6流式细胞仪检测转染后的宫颈癌细胞Hela的凋亡情况胰酶消化收集细胞，4℃PBS洗细胞，重悬，调细胞浓度为1×106/ml，流式细胞凋亡双染色法(Annexin V/FITC和PI)双染细胞，上流式细胞仪分别检测细胞凋亡。其中左上象限为坏死和晚期凋亡细胞(Annexin-/PI+)、右上象限为坏死细胞(Annexin+/PI+)、左下象限为正常活细胞(Annexin-/PI-)、右下象限为早期凋亡细胞(Annexin+/PI-)。

2结果

2.1正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织TFPI-2的表达免疫组化染色结果显示TFPI-2蛋白主要表达在胞质中，呈棕黄色，在正常宫颈上皮组织TFPI-2表达较高，染色较均一；而在宫颈鳞癌组织中表达较低或不表达，CIN组织表达介于正常宫颈组织和宫颈鳞癌组织之间。三者间两两比较差异显著(P<0.01)，见表1，图1。

表1宫颈癌与CIN，正常宫颈组织中TFPI-2表达比较(n)

组别n-+正常宫颈组织12000210CIN组织480219198宫颈癌组织6820281820

图1　正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中TFPI-2的表达(免疫组化染色，×200)

2.2TFPI-2基因转染后宫颈癌细胞Hela中TFPI-2 mRNA及蛋白的表达实验应用real-time PCR检测转染后各组细胞酸氨酸磷酸酶2(SHP-2)mRNA的表达，结果显示，Hela-TFPI-2组细胞TFPI-2 mRNA的表达量为8 652.12±351.04，明显高于转染空白质粒组的1.01±0.05和空白对照组的1.00±0.10(P<0.01)，而空白质粒组和空白对照组间TFPI-2 mRNA的表达无明显差异(P>0.05)，可见pcDNA3.1-TFPI-2质粒可成功将TFPI-2基因转染至Hela细胞，并在细胞中表达。同时，实验采用Western印迹检测转染后各组细胞SHP-2蛋白的表达，其结果与real-time PCR结果一致，见图2。

图2　Western印迹检测转染后各组Hela细胞中 TFPI-2蛋白的表达

2.3TFPI-2基因转染对Hela细胞增殖的影响应用MTT法分别于转染后24 h，48 h，72 h各组细胞的吸光度值进行检测发现，与空白质粒组和空白对照组比较，各时间Hela-TFPI-2组的吸光度值明显降低(P<0.05)，且随着培养时间的延长，各组的差异更明显。说明TFPI-2基因转染可明显抑制Hela细胞的增殖，见图3。

图3　TFPI-2对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

2.4TFPI-2基因转染对Hela细胞凋亡的影响实验应用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测TFPI-2基因转染后各组细胞的凋亡情况，结果显示Hela-TFPI-两组细胞凋亡率为(5.46±0.52)%，而空白对照组和空白质粒组的细胞凋亡率分别为(1.25±0.14)%和(1.23±0.20)%，统计学结果显示，Hela-TFPI-两组的细胞凋亡率明显高于空白对照组和空白质粒组，而空白对照组和空白质粒组的细胞凋亡率间差异无显著性意义。

3讨论

目前对宫颈癌的治疗包括手术、放疗、化疗等，但仍有大量的患者复发而死亡。随着对肿瘤发生发展分子机制研究的不断深入，恶性肿瘤的基因治疗已成为当前肿瘤研究的热点。

TFPI-2，又称胎盘蛋白-5，定位于7号染色体7q22，体内主要以相对分子质量为32 000的形式存在于内皮细胞和成纤维细胞的ECM中。TFPI-2分子共由5个部分组成：富含酸性氨基酸的N端、3个首尾相连的Kunitz结构域和富含碱性氨基酸的C端。TFPI-2通过Kunitz结构域与蛋白水解酶结合来抑制其活性〔6～8〕。TFPI-2属于Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白，是一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制物，研究发现TFPI-2能够抑制ECM相关的胰蛋白酶，纤溶酶，凝血因子Ⅶ(FⅦa)/组织因子复合物等从而维持ECM结构的完整性。同时，TFPI-2可以通过抑制纤溶物和MMPs的活性〔9〕，以及下调血管生成因子(VEGF)的表达抑制肿瘤新生血管的生成，间接抑制肿瘤细胞的增殖〔10〕。研究发现TFPI-2降解丝氨酸的蛋白产物可以结合细胞凋亡受体，引导细胞程序性死亡，从而导致肿瘤细胞凋亡增加，发挥其抗肿瘤效应〔11～13〕。

实验中宫颈癌组织中的TFPI-2表达明显低于正常宫颈组织和CIN组织，可能是TFPI-2的表达减少，导致其与MMPs的结合降低，无法抑制MMPs的活性及血管形成，进而促进了宫颈癌的形成和发展。本实验提示，TFPI-2处理与MMPs作用应用ECM的完整性及影响肿瘤血管生成以外，其对宫颈癌的抑制作用还与其他因素有关，有待进一步的研究。

4参考文献

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〔2013-06-10修回〕

(编辑袁左鸣)