罗丹明B分子印迹固相萃取小柱的研制及应用*

2015-12-24李伟镇刘燕玲吴倩瑜周清

化学分析计量 2015年2期

李伟镇，刘燕玲，吴倩瑜，周清

(1.广东省第一荣军医院药剂科，广州 510260；2.广东药学院药科学院，广州 510006)

罗丹明B(Rhodamine B)是一种桃红色的人工合成碱性染料，主要用于造纸、制漆、纺织、皮革和瓷器的工业染色，也曾用作食品添加剂，但后来证明其具有潜在的致癌和致突变等危险。2008年，罗丹明B在我国被列入第一批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中，欧盟等国家已不允许在食品中使用。但由于罗丹明B具有价格低廉、色泽鲜艳、着色稳定等特点，一些不法商家为了降低成本，常将其作为苏丹红替代品，这给人们的饮食安全带来极大隐患［1］。

目前，罗丹明B的检测主要采用高效液相色谱荧光法、高效液相色谱串联质谱法、高效液相色谱紫外法等［2–4］。由于罗丹明B在食品中添加量一般较小，检测时给样品前处理带来了难度，因此建立一种准确、可靠、简便的前处理方法在食品安全领域有着重要意义。

笔者研制了一种对罗丹明B具有特异识别性能的固相萃取［5–8］小柱，在萃取过程中能同时实现分离和富集，大大简化了前处理过程，同时提高了测量的准确度。该固相萃取小柱选择性较好，可应用于食品、化妆品检测等相关领域。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC–10ATvp型，配有UV检测器和LcSolution色谱工作站，日本岛津公司；

紫外可见分光光度计：TU–1810型，日本岛津公司；

恒温水浴锅：HH–6型，江苏金坛市宏华仪器厂；

水浴恒温振荡仪：金坛市富华仪器有限公司；

固相萃取小柱及筛板：深圳逗点生物科技有限公司；

数控固相萃取仪：SC–8L–150型，广州市智真生物科技有限公司；

罗丹明B：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

偶氮二异丁腈(AIBN)：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

丙烯酰胺(AM)：分析纯，成都市科龙化学试剂厂；

乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)：分析纯，阿拉丁试剂有限公司；

甲醇、乙腈、氨水：分析纯，广州市化学试剂厂。

1.2 罗丹明B分子印迹聚合物的制备

称取0.239 5 g (0.5 mmol )罗丹明B置于圆底烧瓶中，加入100 mL乙腈及15 mL甲醇溶解，加入0.142 2 g (2 mmol)丙烯酰胺(AM)振荡30 min，以使AM和罗丹明B均匀混合并充分作用，然后加入2 mL (10 mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，30 mg偶氮二异丁腈(AIBN)，充分混匀后超声振荡5 min，通N2除氧10 min后密闭，置于65℃恒温水浴中反应24 h，得到红色聚合物沉淀于烧瓶底部。

将上述聚合物用滤纸过滤后包好，放入索氏提取器，用甲醇–氨水洗脱模板分子，直至洗脱液中检测不到模板分子。取出聚合物置于烘箱60℃下干燥，然后密闭放入干燥器中待用。

空白聚合物的制备除不加模板分子外，其余步骤同罗丹明B分子印迹聚合物制备。

1.3 标准工作曲线的绘制

称取罗丹明B 0.239 5 g，用蒸馏水溶解于500 mL容量瓶中，得浓度为1.000 mmol／L的母液。吸取适量母液用蒸馏水稀释成浓度为0.002～0.012 mmol／L的系列标准溶液(10个)。用1 cm比色皿，以蒸馏水为参比，在553 nm波长下测定系列标准溶液的吸光度(A )，以A为纵坐标，以罗丹明B浓度c为横坐标，绘制标准工作曲线。

1.4 络合量测定

称取模板聚合物10份(每份30 mg)，分别置于50 mL具塞锥瓶中，分别加入1.3中系列标准溶液20 mL。置于振荡器上在室温下振荡24 h。用针筒吸取清液，滤膜过滤后取滤液，根据需要稀释，用紫外分光光度法测定吸附后滤液的吸光度，计算模板聚合物对罗丹明B的吸附量。

1.5 固相萃取

1.5.1 固相萃取柱的制作及前处理

准确称取模板聚合物和空白聚合物各0.5 g，分别装入固相萃取小柱中(柱容量5 mL，直径8 mm)，以蒸馏水为匀浆剂，湿法装入固相萃取小柱中，压紧上筛板；用甲醇反复冲洗，制得罗丹明B分子印迹聚合物与非印迹聚合物固相萃取小柱。

1.5.2 固相萃取及洗脱

配制0.05 mmol／L的罗丹明B标准溶液，取5 mL上样，连接固相萃取仪，设定萃取时间约5 min，收集过柱液，根据需要稀释后用紫外分光光度法测定过柱液的吸光度，计算萃取率。

分别用80%甲醇、纯甲醇10 mL洗脱，洗脱时间约5 min，收集洗脱液，根据需要稀释后用紫外分光光度法测定吸光度，计算洗脱率。

1.6 色谱条件

色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，中国迪马公司)；流动相：甲醇–水(体积比为75∶25)，流量为0.6 mL／min；检测波长：553 nm；进样体积：20 μL。

1.7 样品前处理

取3 g市售辣椒，研磨粉碎后置于锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声15 min，静置一段时间后取上层清液，转移入离心管，离心后取上层清液5 mL通过模板聚合物(MIP)小柱。按1.5.2方法处理后收集洗脱液，过0.22 μm膜，吸取滤液0.5 mL并稀释至10 mL。在1.6色谱条件下测量罗丹明B的色谱峰面积。

2 结果与讨论

2.1 印迹聚合物制备条件

为了使模板聚合物具有较佳的选择性和识别能力，选择模板分子、功能单体、交联剂的质量比例为1∶4∶20。制备聚合物过程中，在模板分子中先加入一定量的乙腈和甲醇混合溶剂，再加入AM，混匀，振荡30 min，以便使功能单体与模板分子得到充分混合。随着引发剂(AIBN)用量的增加，聚合速率加快，生成聚合物的相对分子质量减小。实验选择引发剂用量为30 mg。

2.2 标准工作曲线

测定1.3中罗丹明B系列标准溶液的吸光度A，以A对罗丹明浓度(c，mmol／L)进行线性回归，得回归方程为A=95.45c+0.021，线性相关系数r=0.999 9，线性范围为0.002～0.012 mmol／L。

2.3 络合量测定结果

按1.4方法测定吸附前后标准溶液浓度的变化，按式(1)计算吸附量。罗丹明B模板、空白聚合物吸附量测定结果见表1，吸附量对比见图1。

式中：Q——吸附量，mg／g；

c0——吸附前标准溶液的起始浓度，mmol／L；

c——吸附后溶液浓度，mmol／L；

V——加入标准溶液的体积，mL；

M——罗丹明B的相对分子质量，M=479；

30——聚合物取样量，mg。

表1 罗丹明B模板、空白聚合物的吸附量

图1 MIP，NMIP柱吸附量对比

由表1及图1可以看出，罗丹明B模板聚合物(MIP)和空白聚合物(NMIP)的吸附量随着溶液浓度增大而提高，模板聚合物的吸附能力比空白聚合物的吸附能力明显提高，由此可认为罗丹明B模板聚合物对罗丹明B具有特异性识别性能。

2.4 固相萃取实验结果

2.4.1 萃取率

按1.5方法制作固相萃取小柱并进行萃取实验，结果见表2。由表2可知，模板柱的萃取率明显高于空白柱，说明模板柱为特异性吸附起主要作用，呈现出较好的选择性；而空白柱为非特异性吸附起主要作用。

表2 模板、空白聚合物固相萃取罗丹明B实验结果

2.4.2 洗脱剂比较

按1.4方法洗脱被萃取的罗丹明B，洗脱率结果见表3。由表3可知，用80%甲醇能将大部分的罗丹明B洗脱下来；用100%甲醇，基本能将罗丹明全部洗脱下来，洗脱效果显著，因此可直接采用纯甲醇作为洗脱剂。

表3 洗脱剂洗脱能力比较

2.5 方法精密度与回收试验

按1.7方法处理辣椒样品后进行测定，样品中均未检出罗丹明B。在辣椒样品中分别添加3种不同水平的罗丹明B标准溶液，进行回收试验，罗丹明B标准溶液及加标后辣椒样品溶液的色谱图见图2，试验结果见表4。由图2可知，制备的固相萃取柱的选择性较好，由表4可知，平均回收率为90.0%～95.0%，测定结果的相对标准偏差为0.9%～1.7%。