对苯醌与克拉霉素的荷移反应及其应用*

张帆，尚永辉，孙家娟，王丹美，杨健，李悦

（咸阳师范学院化学与化工学院，陕西咸阳 712000）

克拉霉素（Clarithromycin）为20世纪90年代开发的新一代大环内酯类抗生素，为6-O-甲基红霉素［1］，其结构式如图1。

图1 克拉霉素分子结构式

克拉霉素具有对胃酸稳定、口服生物利用度高、清除半衰期长和对组织穿透力强的特点，对呼吸、生殖、泌尿、五官、皮肤及附属结构感染等多种病症具有良好的疗效［2］。我国药典采用高效液相色谱法检测克拉霉素含量［3］，该法实验操作比较繁琐，且费时较长。文献报道测定克拉霉素的方法还有比色法［4］、极谱法［5–6］、荧光法［7］、HPLC–MC法［8］。笔者利用克拉霉素与对苯醌间的电荷转移反应，建立了简便快捷的荷移分光光度法测定克拉霉素的光化学新方法，该方法具有操作简便快捷、灵敏度高、重复性好、选择性好等特点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

紫外分光光度计：Specord 50型，德国耶拿公司；

石英比色皿：宜兴市晶科光学仪器有限公司；

电子分析天平：HA–180MF型，日本日立公司；

克拉霉素标准品：纯度大于99.5%，中国药品生物制品检定所；

克拉霉素标准溶液：1.0×10–4mol／L，称取0.003 7 g克拉霉素标准品，置于烧杯中，用少量丙酮溶解后移入50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至标线，实验所需其它浓度的克拉霉素溶液由此标准溶液稀释而得；

对苯醌：分析纯，上海山浦化工有限公司；

对苯醌–乙醇溶液：0.15 mol／L，称取0.810 8 g对苯醌，置于干燥烧杯中，用乙醇溶解后移入50 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至标线，避光保存，备用；

克拉霉素片：标示含量为250 mg／片，西安利君制药有限责任公司。

1.2 实验方法

分别取一定量的克拉霉素于10 mL比色管中，加入一定量的0.15 mol／L对苯醌–乙醇溶液，采用单因素轮换法考察反应时间、温度、缓冲液、表面活性剂对荷移络合物形成的影响，测定300～700 nm间的电子吸收光谱并记录荷移络合物最大吸收波长处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 荷移络合物的电子吸收光谱

按1.2实验方法分别测定1.5×10–7mol／L的克拉霉素溶液，4.5×10–5mol／L的对苯醌乙醇溶液及1.5×10–7mol／L的克拉霉素溶液和4.5×10–5mol／L的对苯醌–乙醇混合溶液的电子吸收光谱，如图2所示。

图2 荷移络合物和试剂的电子吸收光谱

由图2可知，实验条件下克拉霉素的最大吸收在272 nm处，对苯醌在376 nm处具有较弱的吸收(见放大区域)，克拉霉素与对苯醌混合反应一段时间后，克拉霉素与对苯醌混合体系在360 nm处产生一较强的吸收，该吸收比相同浓度下克拉霉素与对苯醌吸收曲线的简单加和值(见图2中的曲线c)明显增强，该体系的摩尔吸光系数远高于克拉霉素及对苯醌单体，表明克拉霉素与对苯醌之间发生了某种反应，该反应可能是克拉霉素分子上的N原子提供n电子给对苯醌分子的π轨道，生成了电荷转移络合物的结果。

2.2 荷移反应条件探索

2.2.1 溶剂的影响

分别考查了丙酮、乙醇、甲醇、水、甲醇–水（1∶2，体积比，下同）、乙醇–水（1∶2）等6种不同溶剂对克拉霉素与对苯醌荷移反应的影响。结果发现，在甲醇–水（1∶2）的溶剂中对苯醌与克拉霉素反应的荷移络合物特征吸收峰最为明显，故实验选择甲醇–水（1∶2）为溶剂。

2.2.2 反应时间的影响

准确移取1.0×10–4mol／L克拉霉素标准溶液1.50 mL于10 mL比色管中，再加入0.15 mL 0.15 mol／L对苯醌–乙醇溶液，用甲醇∶水（1∶2）溶液定容至10 mL，记录不同反应时间下体系的电子吸收光谱。结果表明，0～45 min内荷移络合物特征吸收峰逐渐增大，50 min后特征吸收峰基本保值不变，表明荷移反应基本完全。实验选取反应时间为60 min。

2.2.3 反应温度的影响

考察了反应温度对对苯醌与克拉霉素荷移反应的影响，结果显示，在较低的温度下荷移反应速度缓慢；而温度太高又会导致荷移络合物的分解。综合考虑，实验选择在39℃下进行。

2.2.4 对苯醌用量的影响

试验了对苯醌的用量对反应的影响，试验过程中恒定克拉霉素的用量，逐渐改变对苯醌的用量，观察体系的电子吸收光谱。结果显示，随着对苯醌用量的增加，荷移络合物特征吸收峰值呈增大趋势，在苯醌的用量为0.3 mL后趋于平缓，说明添加0.3 mL对苯醌可使反应进行得比较完全，因此对苯醌用量选择0.3 mL。

2.2.5 表面活性剂的影响

文献报道表面活性剂对荷移反应具有一定的影响［9］。试验考察了乳化剂OP–10、十二烷基苯磺酸钠、曲拉通x-100、十六烷基三甲基溴化铵、吐温80等5种表面活性剂对对苯醌与克拉霉素荷移反应的影响。结果发现，乳化剂OP–10、十二烷基苯磺酸钠、曲拉通x-100对对苯醌–克拉霉素荷移络合物的反应均具有一定程度的增敏作用，其中加入十二烷基苯磺酸钠的增敏效果最为明显，故实验选择加入0.2 mL 10 g／L十二烷基苯磺酸钠水溶液作为增敏剂。

2.3 克拉霉素的测定

2.3.1 荷移络合物吸光度与克拉霉素浓度的关系

在最佳实验条件下，测定克拉霉素系列标准溶液与0.3 mL对苯醌混合溶液的电子吸收光谱，以荷移络合物的吸光度对克拉霉素质量浓度绘制标准工作曲线，荷移络合物的特征吸收峰360 nm处的吸光度值A与克拉霉素的质量浓度ρ在37.4～186.99 mg／L范围内呈良好的线性关系，线性方程为A=0.002 54ρ+0.597 79，线性相关系数r=0.998 6，以3倍信噪比定义，克拉霉素的检出限为9.33 mg／L。

2.3.2 样品测定及加标回收试验

取克拉霉素片3粒，称量，在研钵中充分研磨，取相当于1／5粒质量的药物粉末于小烧杯中，加入少许丙酮充分溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用乙醇定容至标线，摇匀，备用。

取克拉霉素片样液2 mL于10 mL比色管中，加入0.15 mol／L对苯醌储备溶液0.1 mL，以乙醇∶水（1∶2）定容至标线，摇匀，在最佳实验条件下进行测定，得到克拉霉素质量浓度为39.78 mg／L，加入一定量598.37 mg／L的克拉霉素溶液进行加标回收试验，试验结果见表1。由表1可知，测定结果的相对标准偏差为3.56%，加标回收率为97%～104%，表明本法精密度和准确度均较高。

表1 加标回收试验结果(n=5)

2.4 荷移反应机理探讨

克拉霉素分子中的N原子上有孤电子对(n电子)可作为电子给予体，而对苯醌分子为缺电子体系，可作为π电子接受体，形成n-π型电荷转移络合物。采用等物质的量连续变化法测得克拉霉素与对苯醌反应生成的荷移络合物的组成比为1∶1。

克拉霉素分子中的孤电子对在O原子和N原子上，N原子的电负性小于O原子，N原子对孤电子对的控制相对较弱，更易于向对苯醌转移；此外，根据实验结果，克拉霉素与对苯醌反应生成的荷移络合物的组成比为1∶1，如果是O原子上孤对电子的转移，克拉霉素分子结构中相同微观结构的氧原子有多个，不可能得到络合比为1∶1的络合物，所以克拉霉素与对苯醌之间的荷移反应机理可能如图3所示：

图3 克拉霉素与对苯醌之间的荷移反应机理

3 结语

通过探索溶剂、反应时间及温度、表面活性剂等对克拉霉素与对苯醌荷移反应的影响，建立了测定克拉霉素的光度分析新方法，该方法成功地应用于克拉霉素片中克拉霉素含量的测定，并为克拉霉素与对苯醌荷移反应机理分析提供了技术手段。

［1］Jerry M, Zuckerman M D. Macrolides and ketolides: azithromycin，clarithromycin，telithromycin［J］. Infect Dis Clin N Am, 2004，18: 621–649.

［2］Winkel P，Hilden J R，Fischer H，et al. Excess sudden cardiac deaths after short-term clarithromycin administration in the claricor trial: Why is this so，and why are statins protective［J］.Cardiology，2011，118(1): 63–67.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)［M］.北京：化学工业出版社，2010.

［4］冯玉欢.采用比色法测定克拉霉素片半成品含量［D］.中国科学院上海冶金研究所博士论文，2000.

［5］马淮凌， 徐茂田，宋俊峰.催化氢波–单扫描示波极谱法测定克拉霉素［J］.理化检验：化学分册，2005，41(3): 156–158.

［6］邱则海，拓宏桂.克拉霉素的线性扫描极谱法分析［J］.龙岩学院学报：自然科学版，2010，28(2): 68–71.

［7］李满秀，张红丽，石轶男. β-环糊精增敏荧光法测定克拉霉素含量的研究［J］.分析科学学报，2012，28(5): 701–704.

［8］李新华，程晓华，刘建明，等.克拉霉素血药浓度HPLC–MC测定方法的改进及药代动力学研究［J］.第二军医大学学报，2009，30(9): 1 096–1 098.

［9］程健琳，吕昌银.表面活性剂增敏荷移反应紫外分光光度法测定三聚氰胺［J］.分析试验室，2011，30(8): 65–68.