内吗啡肽-2 的合成

赵红玲，高杨，李云红，尹志峰，王良友

(1.河北省中药研究与开发重点实验室 承德医学院，河北 承德 067000;2.承德天创生物制品有限公司，河北 承德 067000)

内吗啡肽-2(EM-2)是一种具有镇痛作用的四肽，其氨基酸序列为Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2，相对分子量(Mr)571.7。1997 年由美国新奥尔良市都蓝大学神经生物学家Zadina 等［1］在牛脑中发现，它存在于动物和人的中枢神经系统内，是内源性L 阿片受体的激动剂，具有高亲和性和选择性［2］。

文献［3-4］采用液相二肽片段缩合的方法制备EM-2，步骤繁琐，收率低。还有采用基因工程的方法将人源生长因子信号肽与EM-2 融合表达［5］，成本高，不易放大。

本研究采用多肽固相合成法，按照内吗啡肽-2的肽序列，依次从C 端向N 端偶联氨基酸，肽树脂经TFA 裂解得到粗肽，再经反相高效制备液相纯化转盐制备醋酸内吗啡肽-2。此合成工艺操作简单，产品纯度高，重复性好、收率高，适合于工业化放大生产。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Rink Amid 树脂(替代度0.80 mmol/g);Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、1-羟基苯并三唑(HOBT)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰乙醚、二氯甲烷、三氟乙酸(TFA)均为分析纯;乙腈，色谱纯;氨基酸，标准品。

AR224CN 分析天平;HDFD-3 PSA 制氮机;TDL-40B 高速大容量离心机;SHZ-Ⅳ循环水多用真空泵;Heal Force Easy20 纯水机;Agilent 1200 反相高效液相-ESI 质谱联用仪;Newstyle NP7000 反相高效半制备液相色谱仪;LC98-I AAA 氨基酸分析系统;CHRIST ALPHA 1-4 LD 型冻干机。

1.2 EM-2 肽树脂的合成［6］

1.2.1 Rink 树脂脱Fmoc 保护 把Rink Amide 树脂1.259 g(1 mmol)投入到多肽反应柱中，10 mL DMF 溶涨30 min，抽干液体;10 mL DMF 洗涤1 次。分别加入10 mL DBLK(20%哌啶的DMF 溶液)，脱除Fmoc 保护2 次，时间分别是10 min 和5 min，茚三酮检测(Kaiser 法)阳性。分别加入DMF、DCM、DMF 各5 mL，洗涤树脂3 次。

1.2.2 氨基酸偶联 称取Fmoc-Phe-OH 1.165 g(3 mmol)、DIC 0. 557 mL (3. 6 mmol)和HOBt 0.486 g(3.6 mmol)10 mL DMF 溶解，加入到树脂中，N2吹拂搅拌反应2 h，茚三酮检测阴性，抽滤去除反应液。10 mL DMF 洗涤1 次，抽干。分别加入10 mL DBLK(20%哌啶的DMF 溶液)，脱除Fmoc 保护2 次，时间分别是10 min 和5 min，茚三酮检测阳性，分别加入DMF、DCM 和DMF 各5 mL，洗涤树脂3 次。按照上述氨基酸脱保护与偶联方法，依次偶联Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH 和Fmoc-Tyr(OtBu)-OH。肽树脂分别用DMF 洗涤3 次、二氯甲烷洗涤3次，每次洗涤1 min，再用甲醇收缩2 次，每次收缩10 min，抽干甲醇。得到流沙状肽树脂1.873 g。

1.3 肽链切割

向1 g 肽树脂中缓缓加入10 mL－20 ℃预冻的三氟乙酸，室温裂解1.5 h，滤除树脂，将滤液缓慢滴加到60 mL 乙醚中，边加边搅拌，4 000 r/min 离心4 min，倒出上清液，下方沉淀经乙醚洗4 次，真空减压干燥，得到EM-2 粗肽0.644 g。

1.4 EM-2 纯化与转盐

1.4.1 高效液相分析条件 色谱柱为Agela C18柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)，检测波长215 nm，流动相:缓冲液A 为0. 1% TFA/H2O，B 为乙腈，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，洗脱条件B 项5% ～95%，为单一峰，出峰时间为11.891 min，粗肽纯度为98.5%。

1.4.2 制备液相纯化转盐 色谱柱为Hedera ODS-2 反相硅胶柱(20 mm ×250 mm，10 μm)，检测波长215 nm，流动相A 为0.3%醋酸/H2O，流动相B 为乙腈，流速15 mL/min，进样量100 mL，洗脱梯度B:25% ～38%，分布收集，精肽出峰时间为11.837 min，纯度为99.6%(见图1)，冷冻干燥得到干粉0.516 g，得率为80.1%。

图1 EM-2HPLC 精肽分析谱图Fig.1 EM-2 HPLC peptide the fine spectra analysis

2 结果与讨论

2.1 质谱分析

精肽的ESI-MS 谱图见图2，［M + H］+=572.3，与理论值571.7 相符。

图2 EM-2 的ESI-MS 测定谱图Fig.2 EM-2 ESI-MS spectra

2.2 氨基酸组成分析［7］

2. 2. 1 EM-2 酸解衍生 称取5 mg EM-2，放入10 mL安培瓶中，加入6 mol/L 盐酸5 mL 混匀。氮气保护下封口，110 ℃水解24 h。水解液45 ℃减压旋蒸浓缩至干，用0.1 mol/L 盐酸5 mL 溶解。充分溶解后，取0.2 mL 水解液，加入0.1 mL 衍生剂Y(1.2%异硫氰酸苯酯的乙腈溶液)和0.1 mL 衍生剂S(13.9%三乙胺的乙腈溶液)，室温静置1 h。再加入0.4 mL 正己烷振荡，静置10 min，取下层清液稀释5 倍进样检测。

2.2.2 色谱分析条件 色谱柱为氨基酸分析专用ODS 柱，柱温40 ℃，流速1 mL/min，波长254 nm，梯度见表1。氨基酸组成分析结果(图3、图4)为:固相合成EM-2 的氨基酸种类、个数与Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2一致。

表1 梯度洗脱曲线Table 1 Gradient elution curves

图3 氨基酸标准品(A)与EM-2(B)的氨基酸组成分析谱图Fig.3 Amino acid standard and EM-2 (A)(B)the amino acid composition analysis of spectra

2.3 放大实验

不同规模合成实验结果见表2。

表2 放大重复实验数据Table 2 Repeat the experimental data

由表2 可知，实验易于放大，重复性好，收率高而且稳定。

3 结论

内吗啡肽-2 可从动物的组织中分离提取，获得的量有限而且成本高;采用液相合成法制备，产品纯度不高，收率低，满足不了市场的需求。本研究采用多肽固相合成法，操作简便，易于放大，重复性好，收率高。本实验研究的固相合成工艺，对于内吗啡肽-2 的工业化生产具有重要的参考价值。

［1］ Zadina J E，Hackler L，Ge L J，et al.A potent and selective endogenous agonist for the L-opiate receptor［J］.Nature，1997，386:499-501.

［2］ Schild S M，Zadina J E，Gerall A A，et al.Localization of endomorphin-2 like immunoreactivity in the ratmedulla and spinal cord［J］.Peptides，1997，18(10):1641-1649.

［3］ 梁月洁，孟庆国，李明慧，等. 内吗啡肽-2 的合成研究［J］.烟台大学学报，2007，20(1):19-21.

［4］ 李俊，陈钧辉，聂永军，等. 内吗啡肽-2 的人工合成及其酶促降解［J］. 中国生物化学与分子生物学报，2004，20(2):270-274.

［5］ 吴飞翔，俞卫峰，孙玉明.一种高效表达生产内吗啡肽-2 的方法及其应用:CN，103320472A［P］.2013-06-19.

［6］ 高杨，赵红玲，王小青，等.阿基瑞林的固相合成［J］.承德医学院学报，2014，31(5):420-421.

［7］ 王丽莉.多肽类药物的氨基酸检测方法［J］.科技创新与应用，2014(16):272.