荧光定量PCR与ELISA法检测儿童肺炎支原体感染的方法比较

张贻荣，黄世杰，刘云高

福建医科大学附属第二医院晋江分院/福建省晋江市医院检验科,福建晋江362200

荧光定量PCR与ELISA法检测儿童肺炎支原体感染的方法比较

张贻荣，黄世杰，刘云高

福建医科大学附属第二医院晋江分院/福建省晋江市医院检验科,福建晋江362200

目的探讨实时荧光定量PCR与ELISA血清学两种方法学在诊断儿童肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）感染中所具有的临床诊断价值。方法对2013年1月—2014年12月在该院儿科门诊和住院治疗并怀疑MP感染的婴幼儿及儿童，均常规采集咽拭子或痰标本和EDTA抗凝血2 mL的标本共计1 590例，分别用于荧光定量PCR法MP-DNA和ELISA法MP-IgM抗体的检测，并对两组实验结果进行比较分析。结果结果显示MP-DNA阳性共计168例，占10.6%；而MP-IgM阳性共计459例,占28.9%，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。结论实时荧光定量PCR法与ELISA血清学方法对诊断儿童MP感染有着各自的优势，但PCR法的假阳性率低于ELISA血清学方法，更适合用于儿童肺炎支原体感染的早期诊断，若两种方法同时进行，则可以提高临床诊断的准确性。

实时荧光定量PCR；ELISA；肺炎支原体

肺炎支原体(Mycoplasma pneumaniae,MP)主要侵犯呼吸系统，常伴有上呼吸道感染的症状，三分之一的感染者可致肺炎，患儿感染潜伏期为2～3周，在家庭及学校和幼儿园中传播易见，个别患儿可引发肺外并发症，包括脑膜炎、橫断性脊髓炎、心包炎、关节炎和皮肤黏膜损害等，是儿童急性呼吸道感染的主要病原体[1]。近几年，在婴幼儿及儿童人群中，由肺炎支原体引起的呼吸道感染有所上升，如何进行及时有效的诊断，是临床常须面对的问题。荧光定量PCR法和ELISA法作为实验室诊断儿童肺炎支原体感染常用的指标，经常由于两种检测方法敏感性和特异性之间的差异，使在同一患儿身上仍有可能出现两种并不一致的结果[2]。为了探讨MP-DNA和MP-IgM两种方法在儿童早期感染肺炎支原体后，哪种方法更具有诊断价值，收集了2013年1月—2014年12月在该院门诊和住院治疗并怀疑MP感染的婴幼儿及儿童患者共计1 590例进行了MP-DNA和MP-IgM的检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在该院儿科门诊就诊和收治住院的患儿中，收集疑似肺炎支原体感染的婴幼儿及儿童共计1 590例，均进行了MP-DNA和MP-IgM的检测，其中男810例，女780例，年龄0～14周岁。

1.2 仪器与试剂

无菌痰杯和咽拭子购自浙江省拱东医疗科技有限公司，肺炎支原体核酸检测试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，MP-IgM抗体ELISA检测试剂盒购自欧蒙医学诊断股份公司，主要仪器有美国ABI公司生产的ABI 7300型全自动荧光定量PCR扩增仪和伯乐公司生产的Bio-Rad 680型酶标仪等。

1.3 方法

1.3.1 标本采集咽拭子采集：用无菌拭子采集患儿的扁桃体、咽部及咽后壁的分泌物后密封送检，采集时应避免碰舌面及口腔内其它部位。痰标本采集：由于患儿常无法自行咳痰，可用负压吸痰器吸取痰标本置无菌痰杯后送检。血浆标本采集：静脉穿刺采集2 mL静脉血注入EDTA抗凝管中上下混匀，3 000 rpm离心5 min，取上层液体即为血浆标本。

1.3.2 咽拭子或痰MP-DNA检测采用荧光定量PCR法，＞500 copies为阳性。具体步骤：取1.5 mL的无菌离心管，加入1 mL生理盐水，放入拭子并充份震荡，挤干棉拭子里的液体，立即离心或置4℃冰箱备用；痰标本中加入4倍痰体积的生理盐水，充分震荡或用1 mL的枪头反复吸打后置4℃冰箱过夜，使痰充分液化；将处理好的咽拭子标本或吸取液化好的痰标本1～1.5 mL的离心管中，12 000 rpm离心5 min，弃上清液，沉淀物中加入50 uL的DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10 min，12 000 rpm离心5 min，取上清液2uL进行PCR扩增检。试验过程中均设阴性、弱阳性质控品、空白及阳性定量参考品（105、106、107、108基因拷贝/mL），所有操作均严格按照操作说明书进行。

1.3.3 血清MP-IgM检测采用ELISA法检测血中IgM抗体，Cut-off值＜0.8为阴性,≥0.8～1.1为弱阳性（可疑），≥1.1为阳性。具体步骤：向相应微孔中加100 uL标准品、阳性对照、阴性对照及待检标本，室温（18～25℃）温育30 min，倒掉板内液体，用清洗缓冲液洗板3次拍干，每孔滴加100 uL酶结合物室温（18～25℃）温育30 min，洗板3次拍干，滴加显色液A和B各100 uL室温（18～25℃）避光温育15 min后加终止液100 uL，酶标仪450 nm比色测Cut-off值。

1.4 统计方法

所有数据采用SPSS 16.0软件对数据进行分析处理，计数资料用百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MP-DNA的检出率

1590例疑似呼吸道肺炎支原体感染的患儿中，结果为MP-DNA阳性共计168例，总检出率10.6%，其中＜1岁31例，1～3岁79例，4～6岁40例，7～14岁18例。阳性患者主要集中在1～3岁患儿中，在各年龄组之间MP-DNA的阳性率的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 MP-IgM的检出率

1 590例疑似呼吸道肺炎支原体感染的患儿中，结果为MP-IgM弱阳性共计159例，检出率为10.0%,结果为阳性的共计300例，检出率为18.9%，两者阳性结果相加共459例，总检出率为28.9%，其中＜1岁51例，1～3岁278例，4～6岁93例，7～14岁37例，1～3岁和4～6岁两组IgM阳性率显著高于其他组（P＜0.05）。

2.3 MP-DNA的检出率与MP-IgM检出率比较

1590例疑似呼吸道肺炎支原体感染的患儿中，MP-DNA组总检出率为10.6%，MP-IgM组总检出率为28.9%，两组数据差异有统计学意义（χ2=168.23，P＜0.01）见表1。

表1 MP-DNA组MP-IgM组呼吸道感染患儿MP感染阳性率比较[n(%)]

3 讨论

肺炎支原体（MP）肺炎是儿童社区获得性肺炎的常见病因，但其症状、体征及胸部X线胸片等缺乏特异性，确诊往往需要依靠病原学检查[3]。近几年，在儿童社区获得性肺炎中，典型肺炎在广谱抗生素广泛的使用后得到了一定的控制，而由MP感染引起的非典型肺炎却有明显上升趋势,由于缺乏特异性的临床表现，常常未引起临床医生的重视甚至漏诊而引起严重的肺炎,有的还引起严重的并发症或持久的后遗症,严重的肺炎可导致死亡。该研究结果显示MP-DNA和MP-IgM总检出率分别为10.5%和28.9%,检出率分别与文献[4-6]报道的基本一致，两者结果阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）。

血清学ELISA方法是实验室诊断肺炎支原体感染的常用方法之一，该研究通过对不同年龄段的患儿进行分析，发现1～3和4～6岁两组的患儿MP-IgM阳性率显著高于其它组别,而MP-DNA阳性率在各组别之间几乎一致,这说明不同年龄阶段患儿免疫应答存在差异，造成抗体的产生有所不同，由于MP-IgM抗体在体内存在时间短，常常难以把握最佳检测时间,所以血清学方法检测可能具有年龄阶段的差异。而实时荧光定量PCR法则直接检测病原体的目的核酸，不会因为年龄不同而影响检出结果。该次统计血清学ELISA法检测MP-IgM抗体中，结果为弱阳性共159例占10%，阳性300例占18.9%，两者总检出率28.9%，显著高于荧光定量PCR法MP-DNA检测阳性的10.6%（P＜0.05），说明结果存在一定的假阳性率，根据王利君等[7]的统计ELISA血清学MP-IgM方法的灵敏性为98.5%，特异性为70.8%，假阳性率为29.2%,临床需对单份血清抗体阳性结果的解释应持慎重态度，MP-IgM抗体单一阳性结果不适合作为早期儿童肺炎支原体感染的唯一诊断标准。另MP-IgM抗体虽然是MP感染后最早产生的抗体，但其产生仍需一定时间，且必须在感染1周左右才可检测到,10～20 d达到高峰，所以早期的检测仍可能出现假阴性[7]。最好在入院诊断初期和治疗过程的中后期各采集双份血清查MP-IgM抗体，并同时对两份血清IgM抗体的Cut-off值进行动态比较，若Cut-off值进行性升高则诊断价值更大,是临床诊断儿童近期肺炎支原体感染与否较为可靠的免疫学方法。

实时荧光定量PCR法是一种敏感性和特异性均较高的方法，而且简便快速，明显比血清学方法具有优势，已在各大医院广泛开展。通过袁艺等[3]研究结果显示定量PCR的敏感性为92.7%，特异性为93.3%，而IgM抗体检测的敏感性仅为66.7%～83.9%，从而提示荧光定量PCR能更早诊断MP感染，这也与其它文献报道相似[8]。但由于采集的咽拭子及痰标本易受口腔内MP定植的污染，所以MP-DNA的阳性并不能排除病原菌在上呼吸道定植的可能，同时PCR检测的是病原体的核酸，在抗生素治疗后期无法区分病原体是否已被杀死或清除，也不能用于其治疗预后的判断，需根据患儿的临床表现和其他辅助检查结果共同作出合理的诊断。该院目前PCR标本送检率较低，可能是由于患儿小，常常不愿配合咽拭子标本的采集，所以也存在咽拭子标本比血清标本更难采集的问题，也是造成PCR法送检率低的客观原因之一。PCR是一项用于临床病原学诊断的技术，由于采用咽拭子及痰标本时不会出现PCR扩增抑制,同时能够提供定量结果,对患儿呼吸道是否感染肺炎支原体，可以提供准确的诊断依据，是临床诊断肺炎支原体肺炎常用的实验室方法,对患者早期得到有效的治疗具有重要意义。

总之，患儿肺炎支原体的呼吸道感染缺乏临床特异性的诊断，而肺炎支原体的培养与分离鉴定是其诊断的“金标准”，但因其培养周期长，有时需要20 d或更长时间，所以对临床所需的快速诊断意义不大，荧光定量PCR法可以弥补培养在时间方面长的不足，代替分离培养用于临床的早期诊断。在条件允许的情况下，可同时采用荧光定量PCR法与双份血清抗体检测法同时检测，既有利于肺炎支原体肺炎的早期诊断，又能各自弥补两种方法学所存在的局限性，从面提高诊断的准确性，更有利于其早期合理的治疗。

[1]张秀珍,朱德妹.临床微生物检验问与答(第2版)[M].北京：人民卫生出版社,2014：241-243.

[2]方爱姿,钟亮尹,曾淑珍,等.肺炎支原体抗体检测结果及流行病学分析[J].实用医学杂志,2012,28(15)：2611-2613.

[3]袁艺,伏瑾,曹玲,等.肺炎支原体荧光定量聚合酶链反应检测在儿童肺炎支原体肺炎中的诊断意义[J].实用儿科临床杂志,2009,24(10)：760-762.

[4]王汉斌，华春珍，刘霞,等.我院2011-2013年咽拭子肺炎支原体DNA阳性309例分析[J].健康研究,2013(6)：419-423.

[5]斯琼.肺炎支原体感染与患儿性别、年龄和季节的相关性分析[J].中国医师进修杂志,2014(3)：20-22.

[6]陈艳露,宋俊杰,梁红玉.1293例肺炎支原体抗体血清学检测结果分析[J].国际检验医学杂志,2013,34(18)：2470-2471.

[7]王利君,袁梁.儿童血清肺炎支原体抗体IgM两种检测方法比较[J].实用医学杂志，2009，25(19)：3311-3312.

[8]宁瑶,李红胜,陈松劲.实时荧光定量PCR在肺炎支原体DNA检测中的应用[J].浙江临床医学,2014,16(5)：810-811.

Comparison Between FQ-PCR and ELISA in the Detection of Mycoplasma Pneumoniae Infection in Children

ZHANG Yi-rong,HUA NG Shi-jie,LIU Yun-gao
Clinical Laboratory,Jinjiang Branch of the Second Hospital Affiliated to Fujian Medical University(Jinjiang City Hospital), Jinjiang,Fujian Province,362200 China

ObjectiveTo investigate the value of real-time FQ-PCR and ELISA in the diagnosis of mycoplasma pneumoniae(MP)infection in children.MethodsFQ-PCR was used to detect the MP-DNA and ELISA was used to detect the MPIgM antibody in a total of 1590 specimens of conventional throat swab or sputum and 2mL EDTA anticoagulation from the infants and children suspected with MP infection and underwent pediatric outpatient and hospitalization treatment in our hospital from January 2013 to December 2014.And the results of the two sets were analyzed comparatively.ResultsThe results showed that there were 168 cases of positive MP-DNA,accounting for 10.6%,whereas there were 459 cases of positive MP-IgM,accounting for 28.9%,the difference was significant(P＜0.05).ConclusionBoth real-time FQ-PCR and ELISA serological methods have their own advantages in the diagnosis of MP infection in children.But the false positive rate of FQ-PCR is lower than that of ELISA serological method,so FQ-PCR is more suitable for the early diagnosis of MP infection in children,but using both methods can improve the accuracy of clinical diagnosis.

Real-time FQ-PCR;ELISA;Mycoplasma pneumoniae

R725

A

1674-0742（2015）11（a）-0005-03

2015-08-04）

张贻荣(1979.10-)，男，福建晋江人，大专，主管检验师，主要从事临床微生物学与检验工作。