酶联免疫法测定饲料中盐酸克伦特罗

邢 磊，王仁华

(1.江西省兽药饲料监察所，南昌 330029；2.江西农业大学，南昌 330045)

酶联免疫法测定饲料中盐酸克伦特罗

邢 磊1，王仁华2*

(1.江西省兽药饲料监察所，南昌 330029；2.江西农业大学，南昌 330045)

当前关于检测饲料中盐酸克伦特罗的方法主要有酶联免疫法（ELISA）。本试验的目的是为了检验酶联免疫法（ELISA）对饲料中盐酸克仑特罗检测的准确性。试验结果表明：酶联免疫法回收率为86.48%～95.54%，测得的试验数据绘制的标准曲线图的R为0.994，酶联免疫法具有操作简便、分析速度快、灵敏度高、成本低，适合大批量样品的快速筛选。

盐酸克伦特罗；酶联免疫法；饲料

盐酸克伦特罗(clenbuterol，简称CLB)是一种β-类的肾上腺类神经兴奋剂，添加于饲料中能有效地促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，有明显的促生长和提高瘦肉率的作用，但如果在饲料中超量使用，使得人食用CLB残留畜产品后对人体具有很强的毒副作用，因此，盐酸克伦特罗的准确测定显得极为重要。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

ELISA试剂盒、离心机、微量震荡器、酶标分析仪、移液枪、分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 样品的准备

对于固相样品的前处理，分别称取饲料0.5 g，放入4只离心管中并编号1、2、3、4号，在2、3、4号管中分别加入0.4、0.2、0.1 mL的克伦特罗标准品（浓度为100 ng/mL）；再往4个离心管里分别加入0.01M盐酸溶液5 mL，充分混匀放在微量振荡器上振荡，并用1 mol/L氢氧化钠溶液调到pH到7.5±0.5，在每分钟5 000 转离心机中离心5 min。取出200μL上清液加入已经按照1：10的比例稀释好的800μL样品稀释工作液，振荡均匀（放在微量振荡），静置。取50μL用于检测。

1.2.2 检测过程

确认样品已完成前处理，试剂盒中的试剂以及酶标板都已回温充分，从微板上取下所需数量的微孔（将多余的微孔重新封存），在微孔板上进行编号，标记标准品A1 2-F1 2和样品的位置，进行双孔平行实验。在标准孔中加入50 uL盐酸克伦特罗的标准液，浓度 分 别是：0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ng/mL，取50 μL饲料样品溶液注入各样品孔中；用新的吸头配合8道移液枪和加样槽使用，立即在所有孔中加入100 μL的酶标物工作液，注意要正确操作确保将吸头中的液体排空，轻轻晃动反应板几秒钟，在22～25 ℃ 条件下孵育30 min（孵育过程中要不时轻拍震荡酶标板，可减少双孔误差，提高检测准确性）；倒掉微孔中的液体，在微孔中加入用去离子水按1：20（1+19）稀释好的清洗液250 μL，轻轻敲动反应板，然后倒掉微孔中的液体，重复上一步骤，3遍，总共洗板4次，然后将反应板倒扣在吸水纸上拍干，用吸耳球彻底清除掉微孔中的残留液和气泡，清洗程序完成后（立即进行下一步骤，切勿让微孔干燥）。用8道移液枪和加样槽配合使用立即向每个微孔中加入100 μL显色剂，晃动反应板使之混匀，在22～25 ℃条件下显色10 min，用8道移液枪和加样槽配合使用，加100 μL的终止液于每个微孔中，微孔中的颜色由蓝色变成黄色，将酶标仪调至450 nm检测吸光度，结果要在10 min内读取才有效。实验结束后将没有用完的试剂装回试剂盒封存于2～8 ℃的冰箱中。

2 结果与计算

2.1 实验结果

酶标仪读数的结果见表1。

表1 酶标仪读数

2.2 绘制标准曲线

通过测得的6个标准品的吸光度值来绘制ELISA标准曲线，结果均由Romer Log/Logit软件计算得出。根据标准曲线的参数作出标准曲线图1。

2.3 样品及回收率测定结果

依据标准曲线得出的饲料样品中盐酸克伦特罗含量及阳性添加回收率见表3。

在回收率测定试验中，空白对照组检测出盐酸克伦特罗的含量为0.03 ng/ mL低于检测限表明未检出。该豆粕样品的成分较复杂，可能含有与盐酸克伦特罗结构相似的化学成分，引起交叉反应，致使结果出现偏差。在计算回收率时把差值去除即可，测定的回收率在86.48%～95.54%之间。本实验中饲料样品检测限为10 μg/kg。实验结果表明本次实验检测的误差较小，所得结果准确可靠。

表2 标准曲线参数

图1 ELISA标准曲线

3 实验结果分析与讨论

实验结束后，若板孔显示的颜色较淡，原因可能有：试剂盒超过有效期，移液器计量不够准确，洗板及加样过程中，酶标受污染，影响催化剂显色剂显色的能力，洗板次数过多，洗涤冲击力太大。若重复性不好，原因可能是：样品加入后未混匀，洗涤不正确，移液器加酶或显色剂不均。ELISA实验灵敏度较高，因此操作中的各个步骤对实验的检测效果影响较大，稍不注意，就有可能影响测试结果。因此，实验过程必须严格按照要求进行操作。

表3 回收率实验结果

使用试剂盒前必须仔细阅读说明书，严格按照要求进行操作，终止液、显色剂有刺激性，请勿接触皮肤，试剂盒在不使用时，需放置在2～8 ℃干燥保存，不能置于0 ℃以下的冰箱中保存，并确保在有效期之前使用。在使用前，所有试剂及试剂盒内的材料必须室温22～25 ℃回温1 h以上，一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。实验结果的准确度与操作是否规范合理有很大的关系，因此在实验操作过程中必须严格按照实验步骤进行，不要改变分析步骤和中断任何程序，规范使用移液枪不可有气泡，加样时不能加到孔璧上，每次加样移取不同浓度的标准品，都要更换吸头，避免交叉吸取污染标准品，试剂盒使用过程中无需使用盖板膜，无需避光反应，应保证样品萃取液的pH在6.75±0.25。pH过高或过低均会影响检测结果，不能将任何未使用的或用剩的试剂倒回原装瓶中，检验过程中应分清样品与标准品的位置，在检验的整个过程中，任何时候都禁止摇动微孔板以防止微孔内的液体混合。实验中加样过程要快，尽量使前后孔的温育时间保持一致。温育时间要控制准确。

实验结束后应在规定的时间内完成读数，否则将影响实验结果的准确性。

4 总结

本实验用ELISA法检测饲料中的盐酸克伦特罗含量，该方法特异性高、灵敏度高、稳定性好、快速简便，并可同时对多份样品进行快速检测，有较好的应用前景。ELISA因其检测试剂盒检测数量大（一般为96孔板），通常用作大规模样品筛选是目前较常用的检测手段。由测得的试验数据绘制的标准曲线图的R为0.994，测定的回收率在86.48%～95.54%之间。以此数据表明本次实验准确性较高，实验数据可靠。酶联免疫法为饲料产品以及畜产品的安全提供了保障，此方法值得推广。

2015-07-10)

王仁华，高级实验师。