一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

杨 凡，徐志文，李 萍，方和俊，郭 博，周远成

（四川农业大学动物医学院 动物生物技术中心，四川 成都 611134）

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

杨 凡，徐志文*，李 萍，方和俊，郭 博，周远成

（四川农业大学动物医学院 动物生物技术中心，四川 成都 611134）

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织，进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离，将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度，并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果：PRV阳性病料接种PK-15细胞，传至第5代后产生稳定细胞病变，主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑，而对照组细胞贴壁生长良好；基于PRV gE基因的PCR检测，扩增产物为378 bp，与预期目的条带一致；用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×104PFU/mL；琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性，据此为猪场提出综合防治措施。

猪伪狂犬病病毒；分离鉴定；蚀斑实验；琼扩实验；综合防治

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。病猪以新生仔猪的急性死亡，4周龄以上的仔猪出现呕吐、神经症状和妊娠母猪流产、产死胎及呼吸道症状为主要特征，可能引起人的轻微感染[1-3]。伪狂犬病的首次发现追溯到1813年的美国牛群中，随后蔓延分布至全世界。1947年，我国首次报道PRV，目前该病已在国内广泛流行。本病尚无有效治疗的药物，只能靠接种疫苗预防，给养猪业带来了巨大的经济损失[4]。2015年3月，四川崇州某规模化猪场出现疑似伪狂犬病症状病猪，剖检发现患病猪扁桃体、肝和脾均有散在的白色坏死点，肾脏有针尖大小出血点，且出现神经症状的病猪脑脊液增多。本研究拟采集发病猪脑组织，进行基于PRV gE基因的PCR检测，经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞开展病毒分离，并将分离所得病毒株再次进行PCR检测，用蚀斑实验测定该病毒株的滴度，采用琼扩实验对该病毒进一步鉴定[5-9]。最后，根据相应诊断结果提出综合防治措施。

1 材料和方法

1．1 实验材料

1.1.1 病料采集

无菌采集崇州某猪场疑似PRV发病仔猪脑组织，经研钵研磨后，加PBS配制1：5组织悬液，-20 ℃冻存。

1.1.2 实验试剂

1 000单位双抗；猪肾传代细胞（PK-15）由实验室保存；新生犊牛血清、DMEM细胞培养液购自Gibco公司；营养液（含10% 犊牛血清）、维持液（含2% 犊牛血清）、无钙镁水；饱和酚、氯仿、异丙醇、25% 冰乙醇；PRV阳性血清、PCR试剂盒等。

1．2 实验方法

1.2.1 总DNA提取

取出冻存的组织悬液，-20 ℃和37 ℃，反复冻融3次，12 000 r/min 离心5 min；取400 µL上清液于无菌EP管中，加入500µL饱和酚，混匀，静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心5 min；取上清，加入酚、氯仿各200 µL，混匀，静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心5 min；取上清，加入酚、氯仿各200µL，混匀，静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心5 min；取上清，加入400µL氯仿，混匀，静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离 心5 min；取上清，加入2倍体积异丙醇，轻摇约2 min，室温静置15 min，4℃，12000r/min离心15 min；弃上清液，加入1 mL 25% 冰乙醇洗涤沉淀及管壁，4 ℃，12 000 r/min离心5 min；弃上清液，室温干燥沉淀后加入35µL ddH2O溶解，-20 ℃保存备用。同时，提取正常细胞的DNA做阴性对照。

1.2.2 病料PCR检测

根 据GenBank上 发 表 的PRV gE基因保守序列设计合成1对引物，上游引物：5’-TGCTCG TGATGACCCACAAA-3’；下游引物：5’-TGTACACCGGCGAGAGCAT -3’，预期目的片段大小为378 bp。引物序列送至宝生物工程（大连）有限公司合成。

以提取的病毒DNA和正常细胞DNA为模板，按照下列PCR体系（10µL体系）进行扩增（见表1）。

反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，总共35个循环；72 ℃总延伸7 min；4 ℃保存。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察记录实验结果。

表1 PCR扩增体系

1.2.3 病毒分离

取出冻存的组织悬液，反复冻融3次，离心取上清， 每1 mL上清液加1 000单位双抗，置4 ℃处理过夜。

观察培养的PK-15细胞生长状况，当贴壁铺满单层，弃去培养液，无钙镁水洗2～3次，每瓶接种600µL处理好的组织悬液，对照组加入等量培养液。37 ℃吸附作用1 h，在此期间每隔15 min轻轻摇晃细胞瓶，使细胞和病毒液充分接触。每瓶加入4 mL维持液，37 ℃恒温培养箱培养。当细胞病变达70%以上时收毒，即-20 ℃和37 ℃反复冻融3次，3 000 r/min离心15 min，取上清。将收取的病毒液继续接种PK-15单层细胞传代培养，先盲传3代，直至产生稳定的细胞病变，收毒，-70 ℃冻存。

1.2.4 病毒PCR检测

按1．2．1步骤，用酚、氯仿法抽提第5代、第7代病毒液总DNA，进行猪伪狂犬病病毒的PCR检测。同时，应用本实验室建立的猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）RT-PCR检测方法和猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）PCR检测方法，对第7代病毒液进行外源性病毒检测。

1.2.5 蚀斑实验

将六孔培养板中各孔已长满单层细胞的的营养液吸弃，并将第7代病毒液连续进行10倍稀释，选取10-2稀释度，接种于六孔板各孔，每孔0．2 mL，轻轻摇动使病毒液均匀分布于细胞表面；置37 ℃的恒温培养箱培养，吸附1 h后，加入1% 甲基纤维素培养基，使其均匀覆盖于细胞表面；置37℃恒温培养箱中，培养2～7 d；将覆盖的甲基纤维素吸出弃之，用5%福尔马林-1%结晶紫固定染色液固定和染色感染细胞，每孔加入1 mL；20 min后，用水冲洗，观察细胞生长状况，记录蚀斑个数。

1.2.6 琼扩实验

用PBS配制1%琼脂液，倒于平板内制成凝胶。取打孔器在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2 mm，中央孔与周围孔间距约3 mm。将病毒液作2倍倍比稀释，即1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。中央孔滴加PRV阳性血清，周围孔分别滴加稀释后的病毒液。试验设立对照组，中央孔滴加PRV阳性血清，周围各孔均滴加等量的稀释液。保持一定湿度，37 ℃恒温培养箱扩散24 h，观察记录沉淀线情况。

2 实验结果

2．1 病料PCR检测

用组织悬液抽提得到的DNA为模板，进行PCR引物扩增，设立PRV阴性和阳性对照，产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA Marker DL 2 000为标准，病料模板PCR扩增产物大小近似378 bp，扩增出的特异性片段与预期的大小一致（图1）。

2．2 病毒分离

图1 病料PCR产物电泳结果

图2 PRV分离株在PK-15细胞上的变化

经处理的PCR检测为阳性的送检病猪病料，接种PK-15细胞，盲传3代未见明显细胞病变。传至第4代，接毒后46 h可见部分细胞变圆、变亮、脱落形成典型的空斑，对照组无细胞变圆、脱落；病毒传至第5代以后，感染后38 h均可见80%左右细胞产生病变，主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且细胞病变初可见典型的空斑，即在PK-15细胞上产生稳定细胞病变，对照组细胞贴壁良好，无明显细胞病变（图2）。

2．3 病毒PCR检测

用第5、第7代病毒液抽提得到的DNA为模板，进行PCR引物扩增，设立PRV阴性和阳性对照，产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA Marker DL2 000为标准，病毒液模板PCR扩增产物大小近似378 bp，扩增出的特异性片段与预期的大小一致，而外源性病 毒：CSFV、PRRSV、JEV、PPV、PCV2检测均为阴性（图3）。

2．4 蚀斑实验

将收获的第7代病毒液稀释后，选择10-2稀释度接种PK-15细胞，接种后于37 ℃培养箱避光培养5 d，观察并记录蚀斑个数，测得六孔板中平均每孔形成53个蚀斑，则病毒悬液的蚀斑形成单位为2．65 ×104PFU/mL，即每1 mL病毒液滴度为2．65×104PFU（图4）。

图3 病毒PCR产物电泳结果

图4 蚀斑实验结果

2．5 琼扩实验

将病毒液作2倍倍比稀释，实验组中央孔滴加PRV阳性血清，周围孔分别滴加稀释后的病毒液。对照组中央孔滴加PRV阳性血清，周围孔滴加等量的病毒稀释液。结果发现：病毒原液至32倍稀释均可见抗原抗体沉淀带，从64倍稀释度开始未见沉淀带。对照组中均未见抗原抗体沉淀带（见图5）。

图5 琼扩实验结果图

3 结果讨论

目前，我们已掌握许多对猪伪狂犬病病毒进行分离鉴定的方法，比如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、蚀斑实验（plaque formation test）、琼脂凝胶免疫扩散实验（agar gel immunodiffusion test，AGID）等。PCR技术又称为体外基因扩增技术，诞生于1985年。Belak等应用gB基因引物率先建立了检测PRV的PCR方法，检测PRV与其他猪病毒病的多重PCR方法在近年也相继建立。PCR具有敏感、快速、特异性强等优点，还能活体检测大批量样品，目前在病毒鉴定上已经得到广泛运用[5，6]；AGID最早的应用是在1905年为研究利泽甘氏现象，1932年应用于细菌菌株的鉴定。Oudin于1946年在试管中进行了琼扩实验，对抗原混合物进行分析。Elek和 Ouchterlony于1948年分别建立了琼脂双向双扩散法，可以同时鉴定、比较2种以上抗原或抗体，并对免疫扩散的理论依据相继进行了研究。琼扩试验操作简单、快捷，较适用于现场定性诊断和猪群阴性无感染者的普查，但结果易受pH、温度等影响[7]。

PRV广泛分布于机体各组织脏器中，比如扁桃体、肝脏、脾脏、肺和肾脏，但感染量以脑部三叉神经节居多，因此实验中主要采集病猪脑组织进行病毒的分离培养[10-11]。PRV具有泛嗜性，能在许多细胞中增殖，其中以ST细胞和PK-15细胞最敏感，在接种后24～72 h可出现典型的细胞病变，其次是BHK-21、MDBK、CEF等细胞。试验中常用PK-15、BHK-21、MDBK等传代细胞系分离培养该病毒[12]。

本实验从病猪脑组织分离得到1株PRV，对该株病毒进行PCR 检测、蚀斑实验、琼扩实验后，证实该分离是成功的。针对以上实验结果，对猪场建议主要包括以下几个方面。第一，立即淘汰出现相应临床特征的猪群，尤其是仔猪和种猪，同时采用2%～3%氢氧化钠或熟石灰对相应圈舍地面、墙壁及周围场地进行严格消毒处理。第二，抽取猪场中所有猪只血样，并标记清楚。用PRV gE抗体检测试剂盒进行抗体检测，淘汰检测结果呈阳性的全部猪只，阴性猪只进行严格隔离饲养。对测定结果为可疑的猪只先实行隔离饲养，然后重新采血检测，根据检测结果作出相应处理。第三，采集隔离饲养的所有健康猪群血样，进行PRV gB抗体检测，对所有阴性猪只紧急接种弱毒疫苗。第四，完善饲养管理制度。严禁从PRV阳性猪场引种，对待引进猪只采血检测，确定为阴性后方可引进，最好自繁自养。猪群尽量做到全进全出。猪场实行封闭式管理，外来人员必须经过相应消毒措施处理，隔离3 d后才可进入生产区。圈舍和周围场地平时严格消毒，做好清洁卫生。针对不同生长阶段的猪群，合理搭配日粮。第五，制定合理免疫程序。仔猪出生3日龄后进行伪狂犬病疫苗滴鼻免疫，5～6周龄时肌肉注射1头份，种公猪每半年普免1次，母猪产前3个月普免1次[13]。

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2015-09-02）

四川省科技成果转化项目（2013NC0014）；四川省科技支撑计划（2013NZ0016）

杨凡（1992-），男，四川南充人，在读硕士研究生，主要研究方向为动物传染病病原分子生物学。E-mail：abtcyf@126.com

徐志文，教授，博士，预防兽医学。E-mail：abtcxzw@126.com