猪肺炎支原体PCR快速检测方法的建立和应用

李天芝，于新友，沈志强，2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪肺炎支原体PCR快速检测方法的建立和应用

李天芝1，于新友1，沈志强1，2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

根据猪肺炎支原体P36基因序列，设计1对引物，建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法，该方法对猪肺炎支原体的扩增结果为阳性，对照菌株扩增结果均为阴性，对猪肺炎支原体检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测52份猪肺炎支原体疑似病料，检出阳性病例18份，以上结果表明该PCR方法特异性强敏感性高、简便、快速，可用于猪肺炎支原体疾病的诊断。

猪肺炎支原体；PCR；诊断

猪肺炎支原体（Mhp）可引起猪支原体肺炎（MPS），该病又叫猪霉形体肺炎或猪气喘病，是猪的一种高发性、慢性呼吸道传染病，主要临床表现为咳嗽和气喘，一年四季均可发病，但以冬、春寒冷季节较常见，各种日龄猪均可发病，但死亡率低，病猪生长缓慢，饲料利用率低，给世界各国养猪业造成了重大的经济损失[1-2]。猪肺炎支原体传统的检测方法主要有病原分离[3]、核酸探针[4]、间接血凝试验[5]和ELISA[6]等方法这些方法有的操作繁琐，诊断时间长，结果重复性不好，有的难以检测出微量病毒，不适宜疾病早期诊断，本研究设计了针对猪肺炎支原体P36基因的引物，优化PCR反应体系，建立检测了猪肺炎支原体的PCR检测方法，并用该方法对所采集的病料进行检测分析。

1 材料与方法

1．1 菌种和病料

猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、猪巴氏杆菌、猪链球菌2型、猪胸膜肺炎放线杆菌由本实验室分离、保存。病料采自山东省各地猪场临床诊断为猪支原体肺炎的猪肺脏。

1．2 主要试剂及仪器

pMD18-T载 体、Premix Taq、DL2000 Marker购自宝生物工程（大连）有限公司，多功能DNA纯化回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司，PCR仪购自BIO-RAD公司。

1．3 引物设计与合成

参照GenBank发表的Mhp P36（X67286） 基 因 序 列， 用Primer primer5．0软件设计1对引物，P1：5'-G ATTAGTGTCTCCCGTTAT-3'，P2：5'- TCACCCATCACGTAGGCC -3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1．4 PCR模板制备

参照百泰克细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取猪肺炎支原体基因组DNA，并提取其他几种细菌的DNA作为模板。

1．5 猪肺炎支原体P36基因的PCR扩增及条件优化

以基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25 µL，对各扩增条件进行优化，包括退火温度(45～55 ℃梯度温度，每2 ℃为1个梯度)、引物浓度(0．1～1．1 µmol/L，每0．2 µmol/ L为1个梯度)等，最终确定的扩增程序为95 ℃预变性5 min，然后进入95 ℃30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃30 min循环，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。取5 µL产物，1．5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外成像。

1．6 PCR扩增产物的检测及鉴定

首先取扩增产物5 µL在1．5%的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。然后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pMD18-T克隆载体于4 ℃过夜连接，转化感受态菌株DH5α。挑取单个的转化菌落，加LB溶液培养18 h后用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA用PCR方法进行鉴定，将阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。将测序结果与参照的猪肺炎支原体P36基因序列同源性比较。

1．7 特异性试验

分别提取猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、猪巴氏杆菌、猪链球菌2型、猪胸膜肺炎放线杆菌的DNA，用已建立的方法进行扩增。

1．8 敏感性测定

猪肺炎支原体的基因组DNA后定量，然后10倍梯度稀释提取的细菌基因组DNA使其分别相当于含有100 ngDNA、10 ngDNA、1 ngDNA、100 pgDNA、10 pgDNA、1 pgDNA、0．1 pgDNA的含量，分别进行PCR检测，确定其敏感性。

1．9 重复性试验

用建立的PCR检测方法，对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、猪巴氏杆菌、猪链球菌2型、猪胸膜肺炎放线杆菌DNA，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1．10 临床样品的检测

对52份猪肺炎支原体疑似病料，用本试验优化建立的PCR反应体系进行检测，对扩增产物全部进行测序鉴定，并利用生物学软件BLAST进行序列分析。

2 结果与分析

2．1 扩增产物的检测

PCR扩增产物经过1．5%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物在351 bp处可见特异性DNA扩增条带，与预期大小相符（图1）。测序结果显示扩增的序列与参照的猪肺炎支原体P36基因（X67286）的同源性为100%。

2．2 特异性试验

利用所设计的引物及所确定的最佳反应条件分别对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、猪巴氏杆菌、猪链球菌2型、猪胸膜肺炎放线杆菌的DNA进行PCR检测。结果7菌株中只有猪肺炎支原体能扩增出相应的片段，大小分351 bp(预期的为351 bp)，而其他均未扩增出相应的片段（图2）。说明本研究建立的方法特异性好。

图1 猪肺炎支原体扩增结果

图2 特异性试验

图3 敏感性试验

2．3 敏感性试验

取5µL PCR产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约351 bp附近出现特异性条带，与预期产物大小相符。从结果可以看出，该PCR检测灵敏度可以达到1 pgDNA（图3）。

2．4 重复性试验

经过3次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定、可靠的。

2．5 检测方法的应用

用本试验优化建立的PCR方法对52份猪肺炎支原体疑似病料进行检测，4 h内可出结果，检出阳性病例18份，阳性率为34．6%。

3 讨论

本实验参照Genbank中猪肺炎支原体P36基因序列，在其高度保守区设计1对特异性引物，建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法。通过对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、猪巴氏杆菌、猪链球菌2型、猪胸膜肺炎放线杆菌的扩增表明，本试验所建立的PCR检测方法特异性高，敏感性试验结果表明，该PCR检测猪肺炎支原体灵敏度可以达到1 pgDNA。

国内外有关猪肺炎支原体临床病例方面的报道较多，而病原菌检测方法的报道却很少。由于该病传统的实验室检测方法(病原分离与生化鉴定等)繁杂费时，且检出率较低。本实验优化条件建立的猪肺炎支原体PCR检测方法，直接从病料提取细菌DNA，不需要进行病原菌的分离培养，进行PCR扩增，即可判断是否患有猪肺炎支原体感染，该方法具有检测速度快、特异性强、敏感性高等优点。对52份临床疑似病料进行检测，4 h内可出结果，检出阳性病例18份，检出率为34．6%；用传统的实验室检测方法耗时数天，说明PCR方法较传统方法有检测速度快，灵敏度高的优点，能对该病进行有效诊断。本试验建立的猪肺炎支原体PCR检测方法可用于该病的快速诊断与流行病学调查。

[1] 辛彩云，译．国际防制猪支原体肺炎会议报告简介[J]．国外畜牧科技，2001，28(3)：45．

[2] 沈青春，宁宜宝，覃青松．猪肺炎支原体的研究进展[J]．中国兽药杂志，2003，37(6)：26-30．

[3] 孔令增，刘艳芬，刘铀．广东猪肺炎支原体的分离与鉴定[J]．中国兽医科学，2013，43(10)：1016-1020．

[4] 李桂兰，张映，邵国青．猪肺炎支原体斑点杂交检测方法的建立及应用[J]山西农业大学学报(自然科学版)，2012，32(6)：536-539．

[5] 张顺凤．间接血凝试验及猪气喘病检测[J]．甘肃畜牧兽医，1996，26(1)：5-7．

[6] 刘茂军，靳岷，杜改梅，等．检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立[J]．江苏农业学报，2007，23(5)：437-441．

2015-08-07）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-011-14)

李天芝(1985-)，女，汉族，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究。