PRRSV青海株与其他疫苗株对Marc-145细胞的毒力比较

施冲旭，张杰(中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室/国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州730046)

猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称“猪蓝耳”，是一种高度接触性传染病，主要特征是引起母猪发热、厌食和流产、早产、木乃伊胎及弱仔等，在仔猪和生长猪均出现呼吸系统疾病和高度死亡率［1－2］。1987年在美国中西部和1990年在中欧突然出现，随后该病广泛流行于北美、欧洲等养猪国家和地区［3］。1991年荷兰和美国的调查者认定PRRSV是猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)的致病原，PRRS是猪的一种严重疾病［4］。自发现PRRSV以来，该病毒在世界范围内迅速传播，1991年第1次出现在我国，随后迅速流行于全国各地［5］，目前PRRS已经成为全球最具有经济意义的猪传染病。

PRRSV是隶属套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股正链RNA病［6］。病毒基因组长约15．4 kb，包含10个开 放 阅 读 框 (ORFs):ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORFs 3 ～7，包括 ORF5a［7－8］。PRRSV 被分为 2 个主要的基因型:欧洲型(I型)和美洲型(II型)。PRRSV的2个基因型之间接近60% 的基因具有同源性，Lelystad(LV)和VR－2332分别是I型和II型的2个经典代表毒株［9］。

随着我国特有的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株的出现，PRRS的疫情变得更加复杂。与经典毒株相比，HPPRRSV的变异株在细胞适应性和抗原性方面都显著增强，能更快地在猪体内增殖，使感染猪更早出现病毒血症，致病性和致死性能力也显著增强［10－11］。迄今为止，HP-PRRSV毒株在我国的猪群中依然存在，再加上一些中小型养猪场又存在管理不规范的问题，致使HP-PRRS的疫情在我国一些地方依然很严重［12］，使HP-PRRSV毒株变成近年来在我国流行的优势毒株［11，13］。最近又出现了高毒力欧洲毒株(如Lena［14－15］)和高致病性美洲毒株(如 JXA1［10］、HLJA1［16］和HLJB1［17］)，使 PRRSV 显得更加神秘，也给养猪业造成更严重的经济损失。

为了研究青海PRRSV毒株对细胞的适应性和增殖速率以及致病性强弱和毒力，笔者以PRRSV青海毒株、海利和诺倍威CH-1R弱毒疫苗株、吉林GW-HR毒株及其在Marc-145细胞上的传代毒株为研究对象，对4种毒株及其传代毒株的TCID50值和细胞病变作用(CPE)出现的时间进行比较，探讨了PRRSV青海毒株对Marc-145细胞的适应性及其在Marc-145细胞内的增殖速率以及该毒株的毒力。

1 材料与方法

1．1 细胞与毒株 Marc-145细胞来源于中国兽医药品监察所菌种保藏中心;PRRSV青海株由家畜疫病病原生物学国家重点实验室分离并鉴定;CH-1R弱毒疫苗株分别购于上海海利生物技术股份有限公司和浙江诺倍威生物技术有限公司;GW-HR株由家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存。

1．2 主要试剂 DMEM(高糖)培养基，购自GIBCO公司;胎牛血清，购自PAA公司;胰蛋白酶(含EDTA)，购自Bostar公司;1×PBS，购自Sigma公司;台盼蓝，购自Amresco公司;青链霉素双抗，购自Hyclone公司;25 cm2细胞培养瓶、六孔和96孔细胞培养板，购自Corning公司;FITC标记的PRRSV N蛋白的单抗SR30F，购自Rural technologies，Inc(RTI)公司;多聚甲醛，购自Alorich公司。

1．3 Marc-145细胞的传代培养 将试验用的1XPBS和含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基置于37℃水浴锅中预热。选取健康的细胞进行传代培养;弃掉细胞瓶中的培养基，用1×PBS(0．01 mol/L，pH 为7．2)清洗1 ～2 次，然后加入Bostar胰酶进行消化，在37℃温箱消化4 min左右，观察发现当细胞出现圆缩并且彼此分离的现象时，说明细胞已经消化完全;弃掉消化液，加入5 ml左右含10%FBS和1%双抗的DMEM培养基，轻轻吹打细胞后，用移液枪吸出少量细胞悬液，用台盼蓝染色后进行细胞计数;最后，根据计数的结果将细胞用新鲜的含10%FBS和1%双抗的DMEM稀释成1×106个/ml的密度，分装于25 cm2细胞培养瓶中，每瓶10 ml，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1．4 PRRSV的增殖 传代培养的Marc-145细胞，细胞生长密度达到80%左右可进行接毒试验。PRRSV青海株为细胞毒，常温融化后可直接进行接毒;CH-1R株用疫苗伴侣溶液融化后接毒。弃去细胞瓶中的培养基，用1×PBS清洗2次(目的是洗去细胞瓶中的血清，避免血清对接毒试验造成影响);根据TCID50计算的细胞毒价，各组分别按照MOI=0．5、1．0、1．5 和 2．0 的接毒量接毒，将接毒后的细胞放入37℃ 5%CO2恒温培养箱中孵育1 h(使病毒与细胞充分接触);然后弃去细胞瓶中PRRSV毒液，再加10 ml左右含5%PAA血清的DMEM，37℃ 5%CO2恒温培养箱中孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE达到80%时收获病毒。将细胞瓶放入－80℃，反复冻融3次后，2 000 g 4℃离心30 min，取上清，用0．22 μm 的滤膜过滤除菌，分装后 －80 ℃保存备用。

1．5 病毒滴度的测定 采用TCID50方法测定病毒滴度，具体步骤如下:①铺板，将在25 cm2细胞培养瓶中长成单层的Marc-145细胞，弃去培养液，用预温的PBS冲洗2遍，随后加入适量胰酶消化液，37℃培养箱消化4 min左右即可;调整消化好的Marc-145细胞密度为1×105个/ml，用八孔排枪加入到96孔细胞培养板中，每孔200 μl，置于5%CO2的37℃培养箱中培养。②大约24 h后细胞长成单层，小心吸出细胞培养液，并用1×PBS清洗96孔板中的细胞2遍，用不含血清的DMEM培养基将PRRSV病毒液进行连续10倍的稀释，稀释梯度为10－10～100。③将稀释好的病毒液加入到 Marc-145单层细胞孔内，每个稀释度接种8孔(一纵排)，每孔接种病毒液100 μl，用正常不接毒的细胞作对照。5%CO2的37℃培养箱吸附1 h后，加入细胞维持液(5%胎牛血清的DMEM)，100 μl/孔，5%CO2的37 ℃培养箱继续培养。④每隔24 h观察1次，一般需要观察5～7 d。⑤根据CPE出现的情况，采用Reed-Muench法计算病毒TCID50。

2 结果与分析

2．1 Marc-145细胞培养不同时间段的形态观察 Marc-145细胞按照1×106个/ml的密度传代分装于25 cm2细胞培养瓶中后，约48 h生长密度达到100%，可再次进行传代，所以采集了3个不同时间点的细胞形态(图1)。

2．2 PRRSV不同毒株各代次的TCID50值 4株PRRSV体外传代各代次logTCID50值，青海PRRSV传代毒F1～F10代logTCID50值范围为10－9．25～10－4．75个/ml;GW-HR 株F1 ～ F10代 logTCID50值范围为 10－9．2～10－4．7个/ml;海利 CH-1R F1 ～F10 代 logTCID50值范围为 10－8．8～ 10－4．25个/ml，诺倍威 CH-1R F1 ～ F10 代 logTCID50值范围为10－7．6～10－3．35个/ml;应用Graphpad软件对试验数据进行分析。从图2可以看出，QH08株的TCID50在F4代和F5代之间有显著增加(P＜0．005)，到 F8 代时达到最高毒价 10－9．25个/ml，F9 代和 F10代已经趋于稳定。图3是QH08株的F1代到F10每一代都与GW-HR株、HILE株和诺倍威毒株同时比较得出的结果。与GW-HR株相比，F2代F8代都有显著性差异，只有F1代、F9代和F10代没有，说明QH08株在F2～F8代的TCID50值显著高于GW-HR株。与HILE株和诺倍威株相比，F1～F10每一代的TCID50值都有显著性差异，并且P值都小于0．000 1，说明QH08株的毒力明显高于HILE和诺倍威毒株。这说明QH08株的毒力随着体外传代的增加而增加，说明毒株逐渐适应Marc-145细胞的生长环境，但是病毒毒力的增加是有限度的，在F8代已趋于稳定。通过与其他毒株的比较，发现QH08株每一代的毒力都明显高于HILE和诺倍威CH-1R株，F2～F8代高于GW-HR株，说明QH08株的毒力最强。

表2 PRRSV不同毒株体外传代各代次感染Marc-145细胞CPE产生的时间

2．3 不同毒株各代次CPE出现的时间 共选取了4株PRRSV，4株毒株分别在Marc-145细胞上传了10代，分别观察CPE出现的时间。由表2可知，QH08株和GW-HR F1～F4代CPE出现的时间主要集中在35 h左右，而伴随着毒株代次的增加，传代毒株在Marc-145细胞上CPE出现的时间提前，F10代出现CPE的时间已经稳定在26h左右。从F1代到F10代，病毒在细胞上出现CPE的时间缩短10 h，即毒株逐渐适应了Marc-145细胞上的生长环境。海利CH-1R株F1～F4代CPE出现的时间主要集中在43 h左右，到F10代CPE出现的时间稳定在31 h，F1代到F10代CPE出现的时间提前了14 h左右。诺倍威CH-1R株F1～F4代CPE出现的时间主要集中在50 h左右，F5～F10代的CPE时间稳定在42 h左右，随着毒株体外传代代次的增加，CPE出现的时间提前了12 h左右。与QH08株和GW-HR株相比，从F1代到F10代海利CH-1R株CPE出现的时间提前了14 h，诺倍威CH-1R株CPE出现的时间提前了12 h，QH08株和GWHR株在细胞上出现CPE的时间只缩短了10 h左右，说明海利和诺倍威CH-1R对Marc-145细胞的适应性比QH08株和GW-HR株强，原因可能是海利和诺倍威CH-1R都是弱毒疫苗，弱毒疫苗的生产都是经过在Marc-145细胞上多次传代制备的，所以海利和诺倍威CH-1R株对细胞的适应性更强。从F1代到F10代，QH08株在细胞上CPE出现的时间都是最早的，说明QH08株对Marc-145细胞的致病性比其他3株都强。

3 讨论

高致病性PRRS现在仍然是对我国养猪业造成严重危害的头号疫病，目前疫苗接种是对该病预防和控制的最有效方法［18］。笔者选用的CH-1R株就是由PRRSV通过连续性传代致弱获得的弱毒疫苗，PRRSV感染Marc-145细胞后细胞形态发生变化，细胞变圆，细胞之间有间隙。不同毒株在Marc-145细胞上所引起的细胞病变也有明显区别，如接种青海毒株和GW-HR的Marc-145细胞中病变的细胞聚集呈丛状，而诺倍威引起的细胞病变多是均匀的拉网式。此外，随着PRRSV在Marc-145细胞上传代代次的增加，病毒对细胞的适应性逐渐增强，且增殖速率加快，CPE出现的时间提前(F10代较F1代约提前了9 h)。海利CH-1R弱毒疫苗株从F1代到F10代CPE出现的时间提前了14 h左右，诺倍威CH-1R弱毒疫苗株CPE出现的时间提前了12 h，QH08株和GW-HR株在细胞上出现CPE的时间只缩短了10 h左右，CPE出现时间的提前说明病毒对细胞的适应性逐渐增强，且增殖速率加快。因为海利和诺倍威CH-1R株从F1代到F10代CPE出现的时间缩短了14 h，而QH08株只缩短了10 h，这说明海利CH-1R弱毒疫苗株和诺倍威CH-1R弱毒疫苗株对Marc-145细胞的适应性比QH08株和GW-HR株强，原因可能是海利和诺倍威CH-1R都是弱毒疫苗，弱毒疫苗都是Marc-145细胞经过多次传代制备而成的，所以海利和诺倍威CH-1R株对细胞的适应性更强。但是，从F1代到F10代，QH08株在细胞上CPE出现的时间都是最早的，说明QH08株对Marc-145细胞的致病性比其他3株都强。

在TCID50试验中，通过多组培养比对，去掉差异显著值后取均值判断，不同PRRSV株传代毒F1～F10代TCID50值的总趋势为渐变上调的趋势，间接表明PRRSV随着代次的增加，在相同时间、相同条件下培养的Marc-145细胞中复制能力增强。QH08毒株及其体外传代毒株的TCID50在F4代和F5代之间有显著增加(P＜0．005)，当体外传至F8代时达到最高毒价(10－9．25个/ml)，F9代和 F10代已经趋于稳定。与GW-HR株相比，F2代到F8代都存在显著差异，只有F1代、F9代和F10代没有明显差异，说明QH08株从F2到F8代的TCID50值显著高于GW-HR株。与HILE株和诺倍威株相比，从F1代到F10代每一代的TCID50值都存在显著差异，并且P值都小于0．000 1，说明QH08株的毒力明显高于HILE和诺倍威毒株。这说明QH08株的毒力随着体外传代代次的增加而增加，说明毒株逐渐适应在Marc-145细胞的生长环境，但是病毒毒力的增加是有限度的，在F8代时已趋于稳定。通过与其他毒株的比较，发现QH08株的毒力每一代都明显高于HILE和诺倍威CH-1R株，F2～F8代高于GWHR株，说明QH08株的毒力最强。

PRRSV的感染具有阶段性，一般感染后CPE出现的时间和初始病毒感染量(MOI值为0．5～2．0)的关系不大，出现CPE的时间与病毒复制周期的缩短和释放时间的减少有关。PRRSV从F1代到F10代CPE首先出现的时间呈现逐渐缩短到的趋势，说明随着PRRSV毒株代次的增加，病毒在Marc-145细胞上复制周期也在逐渐缩短。PRRSV不同毒株F10代较F1代的复制周期都缩短了12 h左右，表明PRRSV不同毒株F10代都比F1代在Marc-145细胞中的复制能力更强。此外，与海利和诺倍威CH-1R相比，QH08株F1～F10代传代毒株CPE出现的时间都是最早的，QH08株在Marc-145细胞上传到F10代时，CPE出现的时间稳定在26 h左右，这表明与其他3个毒株相比，PRRSV青海株在Marc-145细胞中的复制能力更强，对细胞的适应性较强，增殖速率较快，在致病力和毒力方面也较强。

［1］WENSVOORT G．Lelystad virus and the porcine epidemic abortion and respiratory syndrome［J］．Vet Res，1993，24(2):117 －124．

［2］MEULENBERG J J，PETERSEN-DEN BESTEN A．Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad virus:The glycoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particles［J］．Virology，1996，225(1):44 －51．

［3］BILODEAU R，DEA S，SAUVAGEAU R A，et al．Porcine reproductive and respiratory syndrome in Quebec［J］．Vet Rec，1991，129(5):102 －103．

［4］WENSVOORT G，TERPSTRA C，POL J M，et al．Mystery swine disease in The Netherlands:The isolation of Lelystad virus［J］．Vet Quart，1991，13(3):121 －130．

［5］GAO Z Q，GUO X，YANG H C．Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus［J］．Arch Virol，2004，149(7):1341 －1351．

［6］DOKLAND T．The structural biology of PRRSV［J］．Virus Res，2010，154(1/2):86－97．

［7］JOHNSON C R，GRIGGS T F，GNANANDARAJAH J，et al．Novel structural protein in porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by an alternative ORF5 present in all arteriviruses［J］．J Gen Virol，2011，92(Pt5):1107－1116．

［8］ROBINSON S R，FIGUEIREDO M C，ABRAHANTE J E，et al．Immune response to ORF5a protein immunization is not protective against porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection［J］．Vet Microbiol，2013，164(3/4):281 －285．

［9］MORRISON R B，COLLINS J E，HARRIS L，et al．Serologic evidence incriminating a recently isolated virus(ATCC VR－2332)as the cause of swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)［J］．J Vet Diagn Invest，1992，4(2):186 －188．

［10］TIAN K，YU X，ZHAO T，et al．Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark［J］．PLoS One，2007，2(6):526．

［11］ZHOU Y J，HAO X F，TIAN Z J，et al．Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China［J］．Transbound Emerg Dis，2008，55(3/4):152 －164．

［12］WANG X，HE K，ZHANG W，et al．Genetic diversity and phylogenetic analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in East China［J］．Infect Genet Evol，2014，24:193 －201．

［13］ZHOU Y J，YU H，TIAN Z J，et al．Genetic diversity of the ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in China from 2006 to 2008［J］．Virus Res，2009，144(1/2):136 －144．

［14］KARNIYCHUK U U，GELDHOF M，VANHEE M，et al．Pathogenesis and antigenic characterization of a new East European subtype 3 porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate［J］．BMC Vet Res，2010，6:30．

［15］STADEJEK T，STANKEVICIUS A，MURTAUGH M P，et al．Molecular evolution of PRRSV in Europe:current state of play［J］．Vet Microbiol，2013，165(1/2):21 －28．

［16］TORNIMBENE B，FROSSARD J P，CHHIM V，et al．Emergence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome(HP－PRRS)in medium-scale swine farms in southeastern Cambodia［J］．Prev Vet Med，2015，118(1):93 －103．

［17］LENG C L，TIAN Z J，ZHANG WC，et al．Characterization of two newly emerged isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus from Northeast China in 2013［J］．Vet Microbiol，2014，171(1/2):41 －52．

［18］MU C，LU X，DUAN E，et al．Molecular evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from central China［J］．Res Vet Sci，2013，95(3):908－912．