p66Shc基因调控早期胚胎发育阻滞的研究进展

胡军和，阳仲斌，李 伟，金晨钟，曾 智，吴 娟，张雪娇，王 艳 (湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南娄底417000)

p66Shc基因最早是由Migliaccio等在1999年提出的。研究表明，在小鼠食物摄入和体重无明显变化的情况下，p66Shc基因敲除小鼠的寿命要比对照组小鼠的寿命延长30%，为此命名该基因为“长寿基因”［1］。p66Shc(66-kilodalton isoform of Shc gene products)基因编码一种磷酸化酪氨酸信号适配蛋白，已发现与之相关的3种Shc基因:ShcA、ShcB(Sli)和ShcC(Rai)［2］。p66Shc(66-kilodahon isoform of Shc gene products)是哺乳动物的原癌基因SHC编码3个分子量相近的ShcA蛋白质家族(p46Shc、p52Shc和 p66Shc)中3个成员之一［1］。近年来，随着研究的深入，人们发现p66Shc蛋白在由氧化应激引起的细胞凋亡过程中发挥重要的作用，而且该蛋白的表达水平与其氧化水平呈线性关系［3］。在胚胎早期发育过程中，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是导致胚胎体外发育阻滞的重要原因之一［4］。在正常生理状态下，哺乳动物胚胎在体内发育环境(输卵管和子宫)的含氧量一般为5% ～8%，可见胚胎内ROS水平的高低对其发育非常重要。

1 p66Shc的分子结构及功能

p66Shc的分子结构组成包括PTB(an N-terminal phosphotyrosine-binding domain)、CH1(a central proline-rich domain)、SH2(a carboxy terminal Src homology 2)和CH2(an additional N-terminal proline-rich domain)，主要通过酪氨酸激酶信号通路调控有丝分裂等细胞生物学事件。其中的SH2结构域是发挥功能的主要结合靶位点(如EGF受体或ErbB-2)，PTB结构域可以绑定到磷脂，这说明磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)能够在激活SHC基因中发挥作用;SH2结构域和EGF受体酪氨酸激酶的激活对CH1结构域中的酪氨酸激活具有重要的作用［5］。同时，在p66Shc蛋白上包含2个丝氨酸磷酸化位点(位于CH2结构域中36位丝氨酸和PTB结构域中108位丝氨酸)，其中第1个位点与氧化应激反应有密切的关系，能够影响胞内ROS水平和对UV射线的反应，而且能够被MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号通路调节，并且通过相互作用调控细胞的凋亡［6］。叉头转录因子(Forkhead transcription factor)是36位丝氨酸－磷酸化p66Shc下游调控的主要靶作用位点，这些叉头转录因子家族至少包含80个成员，这些成员在调控凋亡及氧化有着复杂的作用。在淋巴细胞中，细胞因子能够激活叉头转录因子FKHR-L1(Forkhead(Drosophila)homolog(rhabdomyosarcoma)like 1)，这个转录因子通过调控凋亡蛋白BIM(Bel-interaetion mediator)的表达，从而引起线粒体膜的破坏，引起细胞凋亡的发生［7］。同时，也有很多研究表明p66Shc能够通过作用于线粒体调节胞内的ROS水平的高低，引起细胞凋亡或衰老的发生［5］。具体的分子结构及其调控作用型号通路如图1所示。

由此可见，通过p66Shc基因中36位的丝氨酸发生磷酸化，可以提高细胞内ROS水平和激活MAPK通路，同时也能促进叉头转录因子活性的升高，从而加强叉头转录因子调控的相关蛋白(如凋亡蛋白BIM等)的表达，导致细胞内其ROS水平升高和细胞发生凋亡。

2 p66Shc调控活性氧水平研究进展

p66Shc已被研究证实在细胞的氧化应激应答中起重要作用，通过叉头转录因子家族调节胞内氧化还原平衡及凋亡［8］。p66Shc在氧化应激状况下调节FoxO(Forkhead box class O)转录因子的活性，而FoxO是PI3K-AKT-FoxO信号转导途径中的环节［9］。p66Shc上的丝氨酸磷酸化位点的磷酸化状态直接影响着其信号适配功能，从而参与细胞的凋亡调控，而p46/p52Shc通过与细胞表面的有丝分裂信号受体结合从而参与Ras-MAPK(Mitogen activated protein kinase)信号转导途径，此途径影响细胞的增殖和分化［10］。研究表明，p66Shc是P53的下游调控作用因子，2种一起调控ROS水平及细胞凋亡的发生，因为敲除2个基因的细胞内的氧化损伤及DNA断裂显著减少［11］。但是，后来的研究结果却与之不同，认为P53在调控ROS的水平方面未充分发挥作用，主要是p66Shc的作用所引起的［5，12］。最近研究发现，p66Shc的功能主要在于其蛋白特异的N端结构能够形成一个氧化结构单元(这个结构单元能够引起凋亡的发生)，其结构单元能够被2个二硫化物结合形成可变化四聚体化引起激活。其中，谷胱甘肽和硫氧还蛋白的作用能够减弱或灭活p66Shc的氧化应激反应，从而形成一个以硫醇发挥氧化还原作用的传感发生装置，来对包内的ROS水平做出相应的调节反应，导致相应功能反应［3］。有关其调控机制的研究，有报道认为主要通过丝裂原激活蛋白激酶－激活蛋白激酶2(Mitogen activated protein kinase-activated protein kinase 2，MAPKAP-2)作用发挥其调控作用，因为通过免疫共沉淀能够得到2种蛋白的复合体［13］。尽管具体的调控网络不是很清楚，目前大多数研究表明Shc基因表达主要受ROS水平的调节，然后发生磷酸化二激活，同时表带的不同蛋白产物作用方式和功能也不同，如p66Shc可作用于线粒体引起凋亡的发生等。

3 p66Shc调控胚胎发育阻滞的调控网络

Favetta等［12］研究发现有13．5%左右的牛体外生产胚胎阻滞在2－4细胞阶段，一般第一次胚胎分裂发生在激活后的26～48 h，虽然在开始只有大约0．6%比例的胚胎发生阻滞发育，但是在后来的阻滞却有大约14．2%的胚胎发生阻滞;采用实时定量PCR检测这2种阻滞的胚胎，结果表明其p66ShcmRNA的表达都显著高于对照组，但是其p53 mRNA的表达及蛋白的磷酸化等没有明显变化，由此可见其由ROS水平升高引起胚胎的发育阻滞主要在于p66ShcmRNA的表达，而与p53 mRNA及蛋白的表达关系不大。同时，以牛IVF胚胎作为对照组，通过在牛GV期的卵母细胞中注射12 000～24 000个短的发夹式反义RNA p66Shc分子研究其p66Shc分子对由ROS引起的胚胎发育阻滞的影响研究发现，Real-time PCR结果表明试验组的p66Shc的mRNA表达显著低于对照组，但是其内参基因的表达没有差异，同时其荧光染色发现其试验组的荧光显著弱于对照组;在试验组中胚胎发育阻滞的比例显著低于对照组，但是在囊胚阶段其p66ShcmRNA的表达没有显著差异［14］。利用发生胚胎发育阻滞的牛胚胎为研究材料，研究其胚胎内ROS水平与胚胎发育阻滞的联系，其结果发现胚胎在20%的氧浓度下培养会使得其氧化刺激提高近10倍，相应发现在2－4细胞发生阻滞的胚胎比例提高2倍，同时其发育潜能显著低于在5%氧浓度下培养的胚胎;同时，p66ShcmRNA的表达检测发现，其20%氧浓度下显著高于5%的表达水平，但是其p53的表达在2种条件下显著差异［5］。总之，在胚胎培养过程中会产生大量的ROS(如可见光、氨基酸氧化物等)，这些胚胎内ROS水平的升高可能是胚胎在发育过程中发生阻滞现象的重要原因之一。由此可见，胚胎发育阻滞在体外培养胚胎中是一种普通现象，而且与ROS产生及其水平密切相关。

由此可见，p66Shc是外源氧化物质诱导细胞或胚胎内部发生由ROS引起细胞损伤反应的主要作用靶点，能够诱导p66Shc基因表达的加强，从而调控作用于线粒体膜的因子的表达。这些因子作用于线粒体膜后，引起线粒体膜的破坏，导致细胞凋亡的发生，影响其功能的发挥。

总而言之，目前人们胚胎早期发育阻滞的机理不是很清楚，一般认为是由于在胚胎发育过程中合子基因的表达没有有效启动，但是具体的靶基因及相互调控关系也不清楚。尽管已有研究发现p66Shc基因与细胞或胚胎内ROS的产生存在某些联系，但是有关胚胎p66Shc通过调控ROS影响胚胎合子基因表达机制还不是很清楚，有待于进一步研究。

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