红星梨叶片不定梢诱导及增殖培养

苏艳丽，田 鹏，魏闻东

（中国农业科学院 郑州果树研究所，河南 郑州 450009）

红星梨叶片不定梢诱导及增殖培养

苏艳丽，田 鹏，魏闻东

（中国农业科学院 郑州果树研究所，河南 郑州 450009）

为了找到红星梨叶片离体培养的最佳条件，从取材时间、暗培养、植物生长调节物质、不同继代次数等方面研究其对红星梨叶片再生的影响。结果表明：外植体取4月初的茎段较好，选用继代2次植株的叶片，细胞分裂素BA比TDZ效果好，生长素IBA比NAA效果好，暗培养30 d，适合叶片再生的培养基为NN69＋BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L，适合再生苗增殖的培养基为MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L。

红星梨；叶片；再生

红星梨Pyrus communiscv. Starkrimson系郑州果树研究所1988年由新西兰引入国内的优秀全红色西洋梨品种，果实葫芦形，外观鲜红艳丽，风味独特有香气，肉质柔软多汁，风味酸甜清香可口，目前国内生产与市场上数量较少，价格较高，出口前景看好。稳定高效的离体培养体系的建立是遗传转化的基础，虽然国内有关梨离体快繁的报道较多，但有关红星梨的组培研究尚未见报道。本文中主要研究了红星梨叶片再生体系建立的几个影响因子，旨在为红星梨叶片高效离体再生体系建立和进一步红星梨遗传转化体系的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

以郑州果树研究所梨育种试验圃里红星梨的茎段为外植体进行无菌培养，继代培养基为MS＋BA 0.6 mg/L＋IBA 0.4 mg/L＋GA 0.2 mg/L＋蔗糖30 g/L＋琼脂5.5 g/L，pH值调至5.8，取继代30 d的试管苗顶端未展开叶片，垂直叶片中脉横切3刀，远轴面向下，接种在叶片不定梢诱导培养基上，进行叶片不定梢的诱导。

1.2 方 法

1.2.1 不同取材时间对叶片再生的影响

分别在3月中旬和4月初取红星梨茎段进行组织培养，统计不同时期的茎段诱导出的继代苗叶片的再生率。

1.2.2 不同细胞分裂素和暗培养时长对叶片再生的影响

分别暗培养20 d和暗培养30 d，以NN69为基本培养基，观察不同细胞分裂素对叶片再生的影响，2个处理为：①BA 5.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；②TDZ 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L。

1.2.3 不同培养基对叶片再生的影响

以NN69为基本培养基，采用4种不同的激素组合来研究不同培养基对叶片再生的影响，4个处理分别为：①BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋AgNO34.5 mg/L＋CH 300 mg/L；②BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋CH 300 mg/L；③BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L；④BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L。

1.2.4 不同继代次数对叶片再生的影响

分别取继代1次、继代2次和继代4次的叶片进行再生培养，观察不同继代次数对叶片再生的影响。

1.2.5 不同细胞分裂素浓度对再生苗增殖的影响

以MS为基本培养基，生长素用IBA 0.2 mg/L，细胞分裂素BA设3个质量浓度处理：0.5、1.0、1.5 mg/L，赤霉素GA用0.2 mg/L，观察不同细胞分裂素质量浓度下叶片的再生情况。

1.3 计算方法

再生频率＝(再生不定芽叶块数/接种叶块数)×100%；

平均每叶再生不定芽数＝再生不定芽总数/再生不定芽的叶块数；

增殖频率＝(增殖的不定芽数/增殖前不定芽总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 不同取材时间对叶片再生的影响

经调查，3月份取材接种的1批，叶片再生频率为30.5%，平均每叶再生梢数为2.6；4月份取材接种的1批，叶片再生频率为67.6%，平均每叶再生梢数为1.7。经方差分析，P＝0.000＜0.01，2次取材的再生频率差异达极显著，说明不同时期的外植体对叶片再生频率的影响很大。

2.2 不同细胞分裂素及暗培养时长对叶片再生的影响

不同细胞分裂素和暗培养时长对叶片再生的影响见表1。从表1可得出，暗培养20 d时，处理1的叶片再生率为22.2%，较处理2的叶片再生率14.3%提高了55.2%，经T检验，P＝0.006＜0.05，差异达显著水平；暗培养30 d时，处理1的叶片再生率为30.77%，较处理2的叶片再生率21.43%提高了43.6%，经T检验，P＝0.006＜0.05，差异达显著水平。说明暗培养20 d与30 d，处理1的叶片再生率均比处理2高，且观察发现处理1的叶片再生苗长势也比处理2好，处理2的叶片再生苗有大团的白色愈伤，苗子簇状，说明红星梨叶片再生时选用细胞分裂素BA比TDZ效果好。

表 1 不同细胞分裂素和暗培养时长对叶片再生的影响Table 1 Effect of different cytokinins and dark culture duration on leaf regeneration

经方差分析，不同细胞分裂素和暗培养时长对红星梨叶片再生率的影响均达极显著水平，P＝0.000＜0.01。选用细胞分裂素BA时，暗培养20 d叶片再生率为22.2%，暗培养30 d叶片再生率为30.77%，再生率提高了38.6%，经T检验，P＝0.017＜0.05，差异达显著水平；选用细胞分裂素TDZ时，暗培养20 d叶片再生率为14.3%，暗培养30 d叶片再生率为21.43%，再生率提高了49.9%，经T检验，P＝0.017＜0.05，差异达显著水平。说明红星梨叶片再生时，暗培养30 d比暗培养20 d效果好。

2.3 不同培养基对叶片再生的影响

不同培养基中叶片的再生率见表2。从表2可得出，处理1和处理2培养基中分别添加AgNO34.5 mg/L和CH 300 mg/L后，与处理3相比，叶片的再生频率降低了，说明这2种物质对提高红星梨叶片的再生频率没有作用。经方差分析，4种不同的培养基，其得到的叶片再生频率间差异极显著，P＝0.000＜0.01，说明不同生长素对红星梨叶片的再生频率影响较大，生长素用IBA比NAA效果好。

表 2 不同培养基的叶片再生率Table 2 Leaf regeneration frequencies in different media

2.4 不同继代次数对叶片再生的影响

在NN69＋BA5.0mg/L＋IBA0.3mg/L培养基上，继代1、2、4次叶片的再生率分别为33.3%、67.6%、3.7%。可以看出，继代2次的叶片再生率最高（见图1），随着继代次数的增加叶片的再生率下降，因此叶片再生时最好选用继代2次的叶片。

2.5 不同细胞分裂素浓度对再生苗增殖的影响

不同细胞分裂浓度下再生苗的增殖情况见表3。从表3可看出，随着细胞分裂素BA质量浓度的提高，再生苗的增殖率呈先升高又降低的趋势，BA 1.0 mg/L时增殖率最高，达75%（见图2），经方差分析，各处理间增殖率的差异均达极显著水平，P＝0.000＜0.01。选用BA1.0 mg/L时增殖的苗多、苗壮，表现最好，因此培养基MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L可作为红星梨叶片再生苗的增殖培养基，观察发现，用此培养基继续转接增殖，增殖效果越来越好，增殖系数可达3.96。

表 3 不同细胞分裂素浓度下再生苗的增殖情况Table 3 Proliferation status of regeneration seedlings under different concentrations of cytokinins

图 2 叶片再生梢增殖Fig. 2 Proliferation of regenerated shoots from leaves

3 结论与讨论

通过对取材时间、不同细胞分裂素和暗培养时长、不同添加物质、不同继代次数等方面对红星梨叶片再生的影响进行研究，得出红星梨叶片再生可用4月初的茎段为外植体，选用继代第2次植株中上部的叶片，叶片再生合适的培养基为NN69＋BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L，暗培养30 d；适合再生芽增殖的培养基为MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L，增殖系数可达3.96。

不同时期的外植体对叶片再生的影响显著。进行红星梨叶片再生培养时，用茎段作外植体，4月初的茎段较3月中旬的茎段继代苗叶片再生率高。红星梨继代2次的叶片再生率最高，随着继代次数的增加叶片的再生率下降。汤绍虎等[1]对雪青梨的研究中也得出相同的结论。

培养环境也对叶片再生产生十分重要的影响。一般暗培养20～30 d有利叶片不定芽的再生[2-5]。本研究结果表明，不同暗培养时间对红星梨叶片再生效果影响显著，以暗培养30 d为最佳。

培养基中添加AgNO3能促进梨不定芽再生，但在不同的植物生长调节物质配比上，最适AgNO3浓度不同[5-7]。CH 100 mg/L[1]能够明显促进雪青梨不定梢的分化。本文中研究结果表明，培养基中添加AgNO34.5 mg/L和CH 300 mg/L对提高红星梨叶片的再生频率没有作用，可能是添加的浓度不合适。

叶片的不定梢再生受多种因素的影响，基因型是最重要的影响因素，基本培养基影响不定梢能否再生，植物生长物质影响不定梢再生率，3个因素适当配合才能获得最佳的再生效果[2]。已有研究表明[2,5,7-10]，在NN69基本培养基上能高效再生出不定芽，本试验中红星梨能在NN69基本培养基上再生出不定芽，但再生率不高，可能是没有找到最佳的生长调节剂配比。关于BA、TDZ使用效果的比较，报道不尽一致[1-4,7,11-12]，本研究结果表明，红星梨的叶片再生，细胞分裂素BA比TDZ再生效果好，生长素IBA比NAA效果好，与孙清荣等[2]认为基本培养基为NN69，细胞分裂素为BA时，NAA比IBA更有利于西洋梨叶片再生的结论不同。本研究中红星梨的叶片再生率满足不了进一步建立遗传转化体系的要求，细胞分裂素和生长素的最佳配比还有待继续研究。

另外，再生叶片的选择和处理[2,5,7,13]及不同的接种方式[2,5,13]对叶片再生率的影响也不同，采用展开的叶片或其它接种方式是否能提高红星梨叶片再生率有待进一步研究。

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Induction and proliferation culture of adventitious shoots fromPyrus communisleaves

SU Yan-li, TIAN Peng, WEI Wen-dong
(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450009, Henan, China)

In order to find the best conditions of leaves in vitro culture, effects of sampling time, dark culture, plant growth regulators and subculture times on leaf regeneration inPyrus communiswere researched. The results showed that,the best explants were the stem segments in early April, it had best effect that leaves subcultured for two times were dark cultured for 30 days, BA had better effects than TDZ, and IBA had better effect than NAA. Suitable culture medium for leaf regeneration was NN69＋BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L, and suitable culture medium for regeneration seedling multiplication was MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L.

Pyrus communis; leaf; regeneration

S661.2 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2015)01—0103—04

2014-06-18

河南省重点科技攻关项目（082102150011）；河南省重大科技攻关项目（092101110400）。

苏艳丽，助理研究员，硕士。E-mail：suyanli@caas.cn

苏艳丽,田 鹏,魏闻东.红星梨叶片不定梢诱导及增殖培养[J].经济林研究,2015,33(1)：103－106.

[本文编校：闻 丽]