利用电子自旋共振技术研究黄海海燕体壁多糖的体外抗氧化活性

刘 山 李 楠 傅 卉 许 喆 常思佳 秦 磊 董秀萍 启 航（.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 6034；2.国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 6034）

黄海海燕（Asterina pectinifera）俗称海星，属于棘皮动物门，黄海海燕纲，是海洋中常见的无脊椎动物之一［1］。在中国沿海，海星蕴藏量比较丰富，其种类多达100余种，广泛分布在东海、南海、黄渤海、台湾近海等各大海域［2］。海星是凶猛的肉食动物，以鲍鱼、扇贝、海胆等海珍品为食，对沿海养殖造成极大危害。但同时海星作为海产废弃物加工再利用的相关研究越来越引起人们的广泛关注。

海星含有的活性物质主要为皂苷、脂类、甾醇类化合物、多糖和胶原蛋白等。海星体壁的酸性粘多糖与哺乳动物结缔组织中的酸性粘多糖相比，除了含有氨基己糖、己糖醛酸和硫酸基外，还含有岩藻糖［3］。相关研究表明，海星体壁酸性粘多 糖 具 有 增 强 免 疫 力［4］、抗 凝 血［5］、抗 血 栓［6］、降 血脂［7］、降血糖等作用。

多糖具有较好的抗氧化活性。Zhu Bei－wei等［8］从鲍鱼性腺中提取硫酸多糖，试验研究表明鲍鱼性腺硫酸多糖具有显著的清除羟基自由基能力。Huang Gang－liang等［9］提取黄瓜多糖，试验研究表明黄瓜多糖对超氧阴离子具有很强的清除作用。Yang Meng－tao等［10］制备纳米硒牡蛎多糖，试验研究表明纳米硒牡蛎多糖是一种有效的羟基自由基和DPPH自由基清除剂。

电子自旋共振技术（electron spin resonance，ESR）又称电子顺磁共振，是在磁场中测量未成对电子［11］，可以探测和识别具有未成对电子的分子，是检测自由基最直接有效的方法［12］，其检测灵敏度高，样品消耗量小，效率高，ESR是近年来在食品领域新兴的一种检测技术［13］，在黄海海燕酸性粘多糖抗氧化研究方面的应用未见报道。本研究拟以新鲜黄海海燕体壁为原料分别制备黄海海燕粗多糖和精多糖，并应用ESR分别检测两种多糖对羟基自由基、DPPH和超氧阴离子的体外清除作用，以期拓展ESR在水产品加工贮藏及生理活性物质领域的应用，旨在为开发具有抗氧化功能的水产食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄海海燕：大连太平洋海珍品有限公司；

DPPH、嘌呤氧化酶：美国Sigma－Aldrich公司；

次黄嘌呤、EDTA－2Na：生工生物工程（上海）股份有限公司；

二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO）、二乙胺三胺五乙酸（DETAPAC）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；

其余试剂：分析纯，市售。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：AL204型，赛多利斯科学仪器有限责任公司；

磁力搅拌机：90－3型，上海振荣科技仪器有限公司；

台式低速离心机：L550型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

真空冷冻干燥机：ZKBTES－55型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

数控超声波清洗器：KQ－250DE型，昆山市超声仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV－5200型，北京普析通用仪器有限责任公司；

漩涡混合器：XW－80型，上海精科实业有限公司；

荧光酶标仪：M200型，瑞士Tecan公司；

数显恒温水浴锅：HH－4型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

电子顺磁共振波谱仪：A200型，德国Bruker Opertics公司。

1.2 方法

1.2.1 黄海海燕体壁粗多糖及精多糖的制备 将黄海海燕体壁与内脏分离，冻干体壁，粉碎，过200目筛得到体壁干粉。按1∶4（m∶V）的比例加入0.1mol/L的 NaBH4与NaOH的混合溶液，于60℃搅拌过夜。冷却搅拌过夜后的液体，加三氯乙酸将pH值调至4.0，于4 000r/min离心15min；离心后取上清液，调节其pH值为7.0，加入1mg的中性蛋白酶，于50℃搅拌过夜；将搅拌过夜后的溶液冷却，于4 000r/min离心15min。取上清液加入其体积1/8浓度为5%的双氧水，于55℃条件下保温脱色，直至溶液变为淡黄色；加入4倍体积的95%乙醇，于4℃的层析柜中醇沉，4 000r/min离心15min。取沉淀溶于适量水中，60℃水浴加热，使其充分溶解，冻干，得到黄海海燕体壁粗多糖。

将黄海海燕体壁粗多糖提取液的pH值调节至7.0，加入0.5mg的中性蛋白酶，于50℃搅拌过夜。用三氯乙酸调节使pH值为4.0，于4 000r/min离心15min。取上清液，加入4倍体积95%的乙醇，于4℃的层析柜中进行醇沉，10 000r/min离心15min。离心后的沉淀依次用乙醇、丙酮进行洗涤。将洗涤后的固体冷冻干燥，即得到黄海海燕体壁精多糖。

1.2.2 多糖含量的测定 采用苯酚—硫酸法［14］，以干基计算。

1.2.3 清除羟基自由基活性的测定 参照文献［13］。

1.2.4 清除DPPH自由基活性的测定 参照文献［13］。

1.2.5 清除超氧阴离子活性的测定 参照文献［13］。

1.2.6 统计分析方法 用SPSS软件对数据进行统计分析，使用单向方差分析。

2 结果与分析

2.1 粗多糖和精多糖的含量

黄海海燕体壁粗多糖经过2次酶解、除蛋白、乙醇醇沉等一系列方法纯化后，得到黄海海燕精多糖。苯酚硫酸法测得黄海海燕体壁粗多糖和精多糖的含量分别为5.21%，7.50%。

2.2 对羟基自由基的清除作用

由图1可知，ESR检测到典型的峰高为1∶2∶2∶1的加合物特征峰。羟基自由基的ESR信号强度（峰高）随着浓度的增大而减小，表明黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对羟基自由基的清除效果显著增强（P＜0.05）。在20mg/mL浓度时，精多糖对羟基自由基的清除率为40.20%，远高于粗多糖的清除率（7.98%）。黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对羟基自由基清除能力的IC50值分别为59.56，44.96mg/mL。按糖含量计，黄海海燕体壁粗多糖和精多糖清除羟基自由基的IC50分别为3.10，3.37mg/mL，略强于Jiang Chang－xing等［15］报道的青蛤多糖羟基自由的清除活性（IC50＝4.00mg/mL）。

图1 黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对羟基自由基的清除作用Figure 1 The scavenging effect of raw and refined polysaccharide of Asterina pectinifera body walls on hydroxyl radical

2.3 对DPPH的清除作用

由图2可知，黄海海燕体壁粗多糖和精多糖都具有一定清除DPPH的作用，随着浓度的升高，峰高逐渐降低，清除作用增大（P＜0.05）。对于相同浓度的黄海海燕体壁粗多糖和精多糖，精多糖对DPPH的清除能力大于粗多糖，在20mg/mL浓度时，清除率分别为56.98%，39.88%。黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对DPPH清除能力的IC50值分别为27.29，13.97mg/mL。按糖含量计，黄海海燕体壁粗多糖和精多糖清除 DPPH 自由基的IC50为1.42，1.05mg/mL。其清除DPPH 自由基的活性优于文献［16］（IC50＝2.00mg/mL）和文献［17］（IC50＝3.11mg/mL）报道的海参多糖的 DPPH 清除活性。

图2 黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对DPPH的清除作用Figure 2 The scavenging effect of raw and refined polysaccharide of Asterina pectinifera body walls on DPPH

2.4 对超氧阴离子的清除作用

由图3可知，随着浓度的升高，ESR信号强度递减，说明清除超氧阴离子的能力逐渐增强，各浓度间差异显著（P＜0.05）。在20mg/mL浓度时，黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对超氧阴离子清除率分别为37.72%，44.27%。黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对超氧阴离子清除能力的IC50值分别为32.36，30.51mg/mL。按纯糖含量计，黄海海燕体壁粗多糖和精多糖清除超氧阴离子的IC50为1.68，2.29mg/mL，其对超氧阴离子的清除活性强于Liu Xin等［17］报道的海参多糖清除超氧阴离子的活性（IC50＝4.05mg/mL）。

图3 黄海海燕体壁粗多糖和精多糖对超氧阴离子的清除作用Figure 3 The scavenging effect of raw and refined polysaccharide of Asterina pectinifera body walls on superoxide anion

3 结论

海燕体壁精多糖较粗多糖有更好的清除活性，说明黄海海燕体壁多糖是很好的抗氧化物质。并且ESR是研究体外抗氧化活性的一种重要的分析手段。下一步将对黄海海燕体壁多糖的体内抗氧化活性进行研究。

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