紫苏叶多糖活性炭脱色工艺优化

2015-12-21张丽红谢三都林晓燕漳州职业技术学院福建漳州363000福建师范大学闽南科技学院福建泉州3633

食品与机械 2015年3期

张丽红谢三都徐芳林晓燕高宁（.漳州职业技术学院，福建漳州 363000；.福建师范大学闽南科技学院，福建泉州 3633）

紫苏［Perilla frutescens（L.）Britt.］属唇形科紫苏属，是药食两用的一年生草本植物［1－3］。其叶片中含有9种花色素苷及顺式异构体，其中以丙二酰基紫苏宁和紫苏宁最为典型［4－6］。在紫苏叶多糖提取过程中，水溶性的花色素苷与多糖一起被提取出来，导致产品呈现黑紫色或红紫色，降低了紫苏叶多糖的纯度，不利于进一步研究。

目前，有关植物多糖脱色的方法主要有化学方法和物理方法两种。化学方法一般是通过化学物质本身所具有的强氧化性破坏色素结构而不呈现颜色达到脱色目的，如双氧水［7，8］，但容易造成目标物质被破坏而产生严重损失。物理方法是通过吸附剂对色素颗粒的吸附作用使其与目标物质分离而达到脱色目的，常见的吸附剂有活性炭［9－11］和大孔树脂［12－14］。到目前为止，未见有关紫苏叶多糖脱色的研究性报道。

本研究拟以紫苏叶多糖提取液的脱色率和多糖损失率为指标，考察活性炭类型、活性炭用量、脱色时间、脱色温度、脱色pH对紫苏叶多糖脱色效果的影响，并采用响应曲面法优化对各因素进行优化，提高了紫苏叶多糖的纯度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂紫苏：2013年7月采摘自南安市码头镇野生紫苏叶片；粉末活性炭（过120目标准样筛）、条形活性炭、椰壳活性炭：福建省南平元力活性炭有限公司；

D（＋）－无水葡萄糖、柠檬酸、苯酚、浓H2SO4等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：UV－2802S型，龙尼柯上海仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－8型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

旋转蒸发器：RE－2000A型，上海亚荣生化仪器厂；

数显pH计：PHS－3C型，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫苏叶多糖提取液制备流程

新鲜紫苏叶→预处理→浸提→过滤→活性炭处理→过滤、离心→上清液→产品

1.2.2 脱色率的计算

（1）紫苏叶提取液吸收峰的检测：将紫苏叶多糖提取液经全波段扫描，设备参数：中速扫描、波长间隔1.0nm、波长范围190.0～1 100.0nm。

全波段扫描结果显示，在波长为330nm处有吸收峰，故以该波长作用检测波长。

（2）脱色率的计算：根据式（1）计算脱色率：

式中：

Y1——紫苏叶多糖提取液的脱色率，%；

OD0——原样品在波长为330nm处的吸光度；

OD1——处理后的样品在波长为330nm处的吸光度。

1.2.3 多糖损失率的计算采用苯酚—硫酸法［15］测定样品中多糖的含量，并按式（2）计算紫苏叶多糖损失率：

式中：

Y2——紫苏叶多糖损失率，%；

m0——原样品中紫苏叶多糖含量，g；

m1——处理后样品中紫苏叶多糖含量，g。

1.2.4 紫苏叶多糖提取液活性炭脱色工艺的单因素试验

（1）活性炭类型：紫苏叶多糖提取液（pH 6.7）分别添加粉末活性炭、条形活性炭、椰壳活性炭的量均为0.5%，在40℃下脱色20min后过滤，计算脱色率和多糖损失率。

（2）活性炭用量：紫苏叶多糖提取液（pH 6.7）分别添加0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%，2.00%的活性炭在40℃下脱色20min后过滤，计算脱色率和多糖损失率。

（3）脱色时间：紫苏叶多糖提取液（pH 6.7）添加0.75%的活性炭在40℃下分别脱色5，10，15，20，25，30min后过滤，计算脱色率和多糖损失率。

（4）脱色温度：紫苏叶多糖提取液（pH 6.7）添加0.75%的活性炭分别在30，40，50，60，70，80℃下脱色20min后过滤，计算脱色率和多糖损失率。

（5）pH值：采用磷酸缓冲液调整样品的pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.7，7.0，7.5，8.0后添加0.75%的活性炭、在60℃下脱色20min后过滤，计算脱色率和多糖损失率。

1.2.5 响应面法优化活性炭脱色工艺在单因素试验基础上，以脱色率（Y1）和多糖损失率（Y2）作为响应值，根据BBD中心组合设计的原理［16，17］进行响应曲面优化，确定活性炭脱色的最优条件。

1.2.6 数据处理采用Design－Expert 7.1.3数据处理软件对响应结果进行二次多项回归拟合、方差分析、显著性检测、响应面分析和工艺验证实验。

2 结果与分析

2.1 活性炭种类对脱色效果的影响

由图1可知，采用粉末型活性炭的脱色效果最好：脱色率高、多糖损失少。活性炭是通过对色素颗粒的物理性吸附并随活性炭的去除达到脱色目的，与条形活性炭和椰壳活性炭比较，粉末活性炭的比表面积（800～2 000m2/g）最大，吸附能力强，具有速度快、脱色率高、成本低等优点［18－21］。因此，本试验采用粉末型活性炭作用为脱色剂。

图1 不同活性炭种类的脱色效果Figure 1 Effect of the types of activated charcoal on the decolorization

2.2 活性炭用量对脱色效果的影响

由图2可知，活性炭用量的增加，使得紫苏叶多糖提取液的脱色率逐渐增加后趋于平稳，这是因为随着活性炭用量增加，紫苏叶多糖提取液中的色素颗粒几乎被去除而使脱色率增长缓慢；而当脱色率趋于稳定时，多余的活性炭转而吸附多糖导致多糖损失明显地增大，综合脱色率和多糖损失率两个指标试验结果，活性炭用量宜选择0.75%左右为宜。

图2 不同活性炭用量的脱色效果Figure 2 Effect of activated carbon dosage on decolorization

2.3 脱色时间对脱色效果的影响

由图3可知，伴随着脱色时间的增加，紫苏叶多糖提取液脱色率呈先增加后略有下降的趋势，而多糖损失率呈先下降后上升的趋势。当活性炭用量一定时，色素颗粒与多糖分子间存在竞争性吸附关系，因此，脱色时间仅为5min时，脱色率较低而多糖损失率较高；活性炭吸附属物理过程，是一种动态的吸附与解析的过程［22］，因此，随着脱色时间延长，多糖分子解析而色素颗粒进一步吸附导致脱色率继续上升而多糖损失率下降的现象；继续延长脱色时间，色素颗粒可能存在解析过程和多糖分子再吸附缘故而出现脱色率略有下降而多糖损失率上升的现象。

2.4 脱色温度对脱色效果的影响

图3 不同脱色时间的脱色效果Figure 3 Effect of decoloring time on decolorization

图4 脱色温度对紫苏叶多糖脱色效果的影响Figure 4 Effect of decoloring temperature on decolorization

由图4可知，随着脱色温度的升高，紫苏叶多糖提取液脱色率逐渐增加，但持续的高温并未使脱色率显著上长反而导致多糖损失明显增加。这是由于温度升高有利于分子扩散运动及多糖分子的解析从而加强了色素颗粒与活性炭之间的吸附［21］。在较低温度条件下，由于多糖分子解析速度加快而使紫苏叶多糖损失率逐渐下降，但升高温度可能是由于较高温度破坏了多糖结构导致损失率的增加。综合脱色效果，本试验宜采用60℃左右的脱色温度。

2.5 pH值对脱色效果的影响

由图5可知，随着pH的上升，紫苏叶多糖提取液脱色率总体呈下降趋势，多糖损失率呈先下降后上升的趋势。这是因为一般情况下，活性炭在酸性条件下比在碱性条件下的吸附能力强，而多糖在碱性条件下比在酸性条件下稳定。因此，选择pH 5.5时脱色效果较好。

图5 不同pH值的脱色效果Figure 5 Effect of pH on decolorization

2.6 响应面试验结果分析

2.6.1 响应面的试验设计及结果根据单因素试验结果设计响应曲面法的因素水平编码表，见表1。

表1 响应面因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

根据Box－Benhnken设计方案进行响应面试验，所得结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.6.2 模型回归拟合经多元回归拟合后，得到紫苏叶多糖脱色率（Y1）和紫苏叶多糖损失率（Y2）对活性碳用量、脱色时间、脱色温度、pH的二次多项回归方程分别为：

2.6.3 模型有效性检验为检验响应模型的有效性，采用Design－Expert 7.1.3软件对模型进行方差分析，所得结果见表3、4。

表3 回归模型方差分析及系数显著性检验Table 3 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

“＊＊”表示极显著；“＊”表示显著。

变异来源平方和自由度均方 F值 P值显著性模型 502.327 7 14 35.880 5 2.738 9 0.044 0＊X1 0.000 8 1 0.000 8 0.000 1 0.993 8 X2 72.030 0 1 72.030 0 5.498 3 0.037 1 ＊X3 11.603 3 1 11.603 3 0.885 7 0.365 2 X4 10.640 8 1 10.640 8 0.812 3 0.385 2 X1X2 74.822 5 1 74.822 5 5.711 5 0.034 1 ＊X1X3 6.002 5 1 6.002 5 0.458 2 0.511 3 X1X4 9.302 5 1 9.302 5 0.710 1 0.415 9 X2X3 0.250 0 1 0.250 0 0.019 1 0.892 4 X2X4 4.622 5 1 4.622 5 0.352 9 0.563 5 X3X4 165.122 5 1 165.122 5 12.604 4 0.004 0 ＊＊X12 33.779 3 1 33.779 3 2.578 5 0.134 3 X22 51.115 6 1 51.115 6 3.901 9 0.041 7 ＊X32 3.815 6 1 3.815 6 0.291 3 0.599 3 X42 19.934 8 1 19.934 8 1.521 7 0.241 0失拟差 155.497 5 10 15.549 8 18.222 4 0.053 1纯误差 1.706 7 2 0.853 3总和659.531 8 26

由表3可知，方程的模型显著性P＜0.05，显著，则模型有意义；失拟差P为0.053 1＞0.05，不显著，即回归模型与实际的试验数值无明显的差异。该模型的校正决定系数为＝0.967 2，说明该模型至少能解释96.72%响应值的变化，仅仅只有总变异大约3.28%无法解释；而相关系数为R2＝0.961 6，表明该模型具有良好的拟合程度，试验误差小，该模型可用于预测脱色过程色素脱除情况。模型一次项X2（P＜0.05）的系数显著，交互项 X1X2（P＜0.05）的系数显著、X3X4（P＜0.01）的系数高度显著，二次项 X22（P＜0.05）的系数显著，其他项系数均不显著。平方项对响应值有影响，说明响应值与试验因素之间并不是简单的线性关系［23］。

由表4可知，方程的模型显著性P＜0.000 1，极显著，则模型有意义；失拟差P为0.593 5＞0.05，不显著，即回归模型与实际的实验值无明显差异。模型校正决定系数＝0.921 3，说明该模型至少能解释92.13%响应值的变化，但仍然有总变异大约7.87%无法解释；相关系数R2＝0.929 5，表明该模型具有良好的拟合程度，试验误差小，该模型可用于预测脱色过程中多糖损失情况。模型一次项X1、X2、X4（P＜0.01）的系数高度显著；二次项 X22（P＜0.01）的系数高度显著；交互项X2X4（P＜0.000 1）的系数极显著，其他项系数均不显著。平方项对响应值有影响，说明响应值与试验因素之间并不是简单的线性关系。

2.6.4 响应面分析根据响应曲面图和等高线图能直观分析各考察因素之间的交互作用及与响应值之间的关系，见图6～11。

表4 回归模型的方差分析及系数显著性检验Table 4 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

“＊＊”表示极显著；“＊”表示显著。

变异来源平方和自由度均方 F值 P值显著性模型 4 994.615 4 14 356.758 2 10.034 1 ＜0.000 1＊＊＊X1 660.083 3 1 660.083 3 18.565 4 0.000 9 ＊＊X2 672.003 3 1 672.003 3 18.900 6 0.000 9 ＊＊＊X3 92.407 5 1 92.407 5 2.599 0 0.132 9 X4 948.740 8 1 948.740 8 26.684 1 0.000 2 ＊＊X1X2 39.062 5 1 39.062 5 1.098 7 0.315 2 X1X3 7.840 0 1 7.840 0 0.220 5 0.647 1 X1X4 31.922 5 1 31.922 5 0.897 8 0.362 1 X2X3 30.250 0 1 30.250 0 0.850 8 0.374 5 X2X4 1 207.562 5 1 1 207.562 5 33.963 7 ＜0.000 1 ＊＊＊X3X4 42.902 5 1 42.902 5 1.206 7 0.293 5 X12 1.001 5 1 1.001 5 0.028 2 0.869 5 X22 731.120 4 1 731.120 4 20.563 4 0.000 7 ＊＊X32 0.171 2 1 0.171 2 0.004 8 0.945 8 X42 148.637 9 1 148.637 9 4.180 6 0.063 5失拟差 356.367 5 10 35.636 8 1.0140 4 0.593 5纯误差 70.286 7 2 35.143 3总合5 421.269 6 26

由图6（a）可知，活性炭用量和脱色时间对紫苏叶多糖提取液的脱色率的影响明显，曲线变化均较为陡峭，但从等高线图可知二者的交互作用不显著。由图6（b）可知，活性炭用量和脱色时间对紫苏叶多糖损失率的影响明显，曲线变化较为陡峭，二者的交互作用显著，表现为等高线呈椭圆形。

由图7（a）可知，活性炭用量对紫苏叶多糖提取液脱色率的影响明显，脱色温度的影响不明显，且二者的交互作用不显著。由图7（b）可知，曲线变化均较为陡峭，故活性炭用量和脱色温度对紫苏叶多糖损失率的影响明显，但二者的交互作用不显著。

图6 活性炭用量和脱色时间对紫苏叶多糖脱色效果的交互效应Figure 6 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and decoloring time on decolorization of perilla leaf polysaccharide

由图8（a）可知，活性炭用量和pH对紫苏叶多糖提取液脱色率的影响明显，但二者的交互作用不显著。由图8（b）可知，曲线变化均较为陡峭，故活性炭用量和pH对紫苏叶多糖损失率的影响明显，但二者的交互作用不显著。

图7 活性炭用量和脱色温度对紫苏叶多糖脱色效果的交互效应Figure 7 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and decoloring temperature on decolorization of perilla leaf polysaccharide

图8 活性炭用量和pH对紫苏叶多糖脱色效果的交互效应Figure 8 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

图9 脱色时间和脱色温度对紫苏叶多糖脱色效果的交互效应Figure 9 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring time and decoloring temperature on decolorization of perilla leaf polysaccharide

由图9（a）可知，脱色时间对紫苏叶多糖提取液脱色率的影响明显，脱色温度的影响不明显；等高线图呈椭圆形，说明二者的交互作用显著。由图9（b）可知，曲线变化均较为陡峭，故脱色时间和脱色温度对紫苏叶多糖损失率的影响明显，但二者的交互作用不显著。

由图10（a）可知，脱色时间和pH对紫苏叶多糖提取液脱色率的影响明显；等高线图呈椭圆形，说明二者的交互作用显著。由图10（b）可知，曲线变化均较为陡峭，故脱色时间和pH对紫苏叶多糖损失率的影响明显，但二者的交互作用不显著。

由图11（a）可知，脱色温度和pH对紫苏叶多糖提取液脱色率的影响明显，但二者的交互作用不显著。由图11（b）可知，曲线变化均较为陡峭，故脱色温度和pH对紫苏叶多糖损失率有影响，但二者的交互作用不显著。

图10 脱色时间和pH对紫苏叶多糖脱色效果的交互效应Figure 10 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring time and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

图11 脱色温度和pH对紫苏叶多糖脱色效果的交互效应Figure 11 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring temperature and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

2.6.5 工艺验证实验采用 Design－Expert7.1.3软件分析回归模型，得出紫苏叶多糖的最优脱色工艺参数：活性炭用量0.58%，脱色时间15min，脱色温度50℃，pH 6.0，紫苏叶多糖脱色率的预测值为99.99%，紫苏叶多糖损失的预测值为5.05%。采用上述优化的脱色工艺条件进行验证实验，所得紫苏叶多糖脱色率为99.63%、紫苏叶多糖损失率为5.25%，与理论预测值差别不大。

3 结论

植物色素苷在紫苏叶片中大量存在且与所提取的多糖具有相同的溶解性能，均为水溶性。提取时，大量的色素被提取出来混入多糖中，为了进一步研究紫苏叶多糖的生物活性、多糖组成及结构等，必须对其进行分离纯化。活性炭法脱色具有吸附性能强、反应条件温和、操作简便等优点，成为植物多糖脱色处理的常用方法之一。在单因素试验基础上，响应面法优化活性炭脱色的结果表明，紫苏叶多糖提取液的最佳活性炭脱色工艺条件为：活性炭用量0.58%，pH 6.0，温度50℃，时间15min，紫苏叶多糖提取液脱色率达99.99%，多糖损失率为5.05%。与其它植物多糖脱色工艺比较，本研究具有高脱色率、低多糖损失的优点。

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