右旋糖苷修饰超氧化物歧化酶及其产物活性研究

李 亮 赵有玺 冀颐之 龚 平（北京联合大学生物化学工程学院，北京 0003）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），是一类广泛存在于生物体内的金属酶。因为能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，己成为生化研究领域的热门课题。SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤及自身免疫治疗等方面显示出独特的功能［1］，在医学、食品、化妆品等领域应用价值很大。不同介质中SOD活性的稳定性，是制约其应用的关键因素之一。常用的解决方法包括对SOD相关氨基酸残基进行化学修饰，水溶性大分子（如聚乙二醇、聚蔗糖和聚烯属烃基氧化物等）对SOD进行共价修饰，以及酶切改造等等$2－5%。

在牛血清白蛋白、月桂酸、褪黑素、不饱和脂肪酸、环糊精、羧甲基纤维素、肝素、卵磷脂等可用于修饰SOD的修饰剂［6，7］中，右旋糖苷作为一种具有良好的生物相容性和水溶性的天然大分子多糖，其糖链上的醛基经活化后可与酶蛋白分子上的游离氨基共价结合［8，9］，是目前应用广泛的酶分子及蛋白质修饰剂之一。但关于其修饰SOD的报道较少［10］。

本研究拟采用右旋糖苷修饰SOD，通过紫外分光光度法测定修饰酶在高温环境、酸性、碱性以及有机溶剂条件下的酶活性稳定性变化，并采用红外光谱法确认修饰反应。旨在改善SOD在不同环境条件下的酶活稳定性，为SOD的应用提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

超氧化物歧化酶：植物来源，200IU/mg，北京经科宏达生物技术有限公司；

右旋糖苷：重均分子量（Mw）为1 500，国药集团北京化学试剂公司；

高碘酸钠、亚硫酸氢钠、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷Tris盐、EDTA、酒精等试剂：除特别注明外均为分析纯，国药集团北京化学试剂公司。

1.1.2 主要仪器设备

傅里叶变换红外光谱仪：PE Spectrum 2型，美国PE公司；

紫外—可见光分光光度计：PE lambda35型，美国PE公司。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖苷修饰SOD反应原理 右旋糖苷是由α－葡萄糖通过α－1，6－糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。通过高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶分子上的氨基结合生成修饰酶。用高碘酸来调节右旋糖苷的氧化程度。一般氧化程度达20%～25%时，与酶具有较高的结合能力。

1.2.2 修饰反应过程

（1）透析袋预处理：将透析袋剪成适当长度（15cm）的小段；在600mL的2%（m/V）碳酸氢钠和1mmol/L EDTA（pH 8.0）中将透析袋煮沸10min；用蒸馏水彻底清洗透析袋1 h；置于1mmol/L EDTA （pH 8.0）中煮沸10min；冷却后，存放于1mmol/L EDTA中，确保透析袋始终浸没在溶液内。

（2）右旋糖苷活化处理：称取0.5g右旋糖苷，加入100 mL蒸馏水中，水浴溶解，当溶液澄清时取出放置至室温，再置于冰箱，让其温度降至4℃；配制12%的高碘酸钠溶液，于4℃向活化后的右旋糖苷中逐滴加人12%的高碘酸钠溶液0.5mL，避光条件下继续搅拌20min，避光低温保存过夜；以新配置的5%的亚硫酸氢钠溶液滴定未反应的高碘酸钠至琥珀色，滴定到接近终点时会出现红褐色沉淀，摇动会溶解，不可出现黑色沉淀颗粒；将滴定后的活化糖苷用蒸馏水透析至完全透明时，换水继续透析2h后取出；将透析出的活化糖苷用聚乙二醇反透析至约3～5mL。

（3）SOD的修饰：将反透析后的活化糖苷，溶解于10 mL的碳酸缓冲溶液（pH 9.0）中；取0.01g SOD，溶于5mL蒸馏水，将调好pH值的活化糖苷滴加入SOD溶液并缓慢搅拌，4℃反应20h，期间每隔一段时间缓慢摇匀；加入7.5%的甘氨酸溶液终止反应；4h后取出反应液，放入截留分子量为3 500的透析袋中蒸馏水透析，至透析液pH值为中性时，取出透析物冷冻干燥得到冻干品，冻干品呈白色或淡黄色。

1.2.3 原SOD酶和右旋糖苷修饰酶酶活测定 采用邻苯三酚终止剂法$11%。

1.2.4 修饰反应的结构分析 采用红外光谱法。KBr压片。

2 结果与分析

2.1 SOD酶活的热稳定性分析

分别将植物SOD干粉、右旋糖苷修饰SOD溶解于蒸馏水中，置于70℃水浴，一定时间后取出进行酶活分析，结果见图1。

图1 修饰前后SOD在70℃下酶活随时间的变化Figure 1 The relation of SOD enzyme activity on time，before and after modification

由图1可知，修饰后SOD初始活性有所下降。这可能是由于右旋糖苷的加入使SOD分子量增大导致的，也可能是由于70℃已经超出酶的最适温度，导致酶变性加剧引起的。但是经右旋糖苷修饰后的SOD热稳定性要高于未经修饰的。这是因为酶与右旋糖苷交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，减少了酶分子内部基团的热振动，从而增强了酶的热稳定性［12］。原酶在70℃条件下，酶活明显下降，5min后下降到30%，15min后完全失活。而经修饰后的SOD失活速率明显低于原酶，5min内仅下降到70%，20min后仍具活性。

2.2 SOD在酸性条件下酶活稳定性分析

分别将植物SOD干粉、右旋糖苷修饰SOD溶解于pH 5.2Na2HPO3—KH2PO3缓冲溶液，置于30℃水浴，一定时间后取出进行酶活力测定，结果见图2。

图2 修饰前后SOD在酸性Na2HPO3—KH2PO3缓冲溶液中酶活随时间的变化Figure 2 The relation of SOD enzyme activity on time in acid Na2HPO3—KH2PO3buffer solution，before and after modification

由图2可知，SOD在酸性条件下酶活整体下降。这可能是因为该pH值低于SOD酶的最适pH，导致酶失活引起的。经右旋糖苷修饰后的SOD在酸性环境中稳定性明显高于未经修饰的。这是因为右旋糖苷的空间保护，降低了SOD酶活性中心的暴露程度，从而减缓了活性损失的速度。原酶在pH 5.2条件下，酶活明显下降，5min后下降50%，15min后完全失活。而经修饰后的SOD失活速率明显低于原酶，5 min后仅下降10%，20min后仍具有活性。

2.3 SOD在碱性条件下酶活稳定性分析

分别将植物SOD干粉、右旋糖苷修饰SOD溶解于pH 10.8Na2CO3—NaHCO3缓冲溶液，置于30℃水浴，一定时间后取出进行酶活测定，结果见图3。

比较图2、3可知，SOD在碱性条件下的酶活比酸性条件高。这可能是pH值变化能引起酶分子中可离解极性基团的离解状态和电荷发生改变，改变酶的构型和构象，影响了酶分子的电荷分布，从而影响酶的最适pH值所致［13］。图3中，经右旋糖苷修饰后的SOD在碱性环境中稳定性要好于未经修饰的。原酶在pH 10.8条件下，酶活明显下降，5min后下降了70%，10min后已完全失活。而经修饰后的SOD失活速率明显低于原酶，5min内仅下降了10%，20 min后仍具有初始酶活力的40%。

图3 修饰前后SOD在碱性Na2CO3—NaHCO3缓冲溶液中酶活随时间的变化Figure 3 The relation of SOD enzyme activity on time in base Na2CO3—NaHCO3buffer solution，before and after modification

2.4 SOD在乙醇溶液中酶活稳定性分析

分别将植物SOD干粉、右旋糖苷修饰SOD溶解于浓度分别 为5%，10%，15%，20%，25%，30% 的 乙 醇 缓 冲 溶 液，5 min后取出进行酶活力测定，结果见图4。

图4 修饰前后SOD在乙醇溶液中酶活的变化Figure 4 The relation of SOD enzyme activity on ethanol concentration

由图4可知，随乙醇浓度升高，SOD活性呈现先升高后下降的趋势；修饰后的SOD比未修饰的酶活高，在乙醇浓度为30%时，前者的酶活是后者的1.7倍。这可能是由于水溶性有机溶剂乙醇使SOD溶解能力升高，酶活因此升高；随着乙醇浓度的逐渐升高，溶剂极性降低，SOD内部的非极性疏水基翻出机率增大，从而使酶的活力降低［14］。

2.5 SOD修饰反应红外光谱分析

修饰反应前后物质的红外光谱图见图5、6。

图5 SOD红外光谱图Figure 5 The IR Spectra of SOD

图6 右旋糖酐修饰SOD的红外光谱图Figure 6 The IR spectra of dextran－modified SOD

图5中3 442cm－1吸收带是肽键的—NH振动吸收带。由于活化右旋糖苷修饰的SOD中醇羟基—OH的伸缩振动［15，16］，该吸收带迁移至3 398cm－1处，形成更强的吸收（图6）。由于—OH之间，以及—OH和—NH的氢键缔合，使得峰型变宽。

更为关键的红外吸收变化出现在官能团区。图5SOD红外图谱中1 657cm－1吸收峰是由肽键中C═O双键振动引起的。而图6中，相关吸收在修饰的SOD中出现了1 637cm－1的吸收带。这是多糖类物质最具特征的红外吸收之一。该吸收带由部分活化糖苷在与SOD共价结合时带入，由此证实该SOD被糖苷成功修饰。

3 结论

本试验采用右旋糖苷对超氧化物歧化酶进行修饰，通过红外光谱证实该修饰反应的发生。通过邻苯三酚终止剂法分别测定了高温（70℃）、酸性及碱性条件下以及水溶性有机溶剂中修饰前后SOD活性变化情况。酶活测定结果表明，经修饰后的SOD在70℃高温、pH 5.2的酸性、pH 10.8的碱性条件下20min不失活，且可以保持一定活性。右旋糖苷修饰能提高SOD酶活稳定性，是增强酶稳定性的有效方法之一。

本研究对提高SOD稳定性，改善SOD易失活及在体内的半衰期较短等应用性能提供了一种可行手段，为SOD在医药、食品及化妆品等方面的推广应用提供了试验数据。

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