丙戊酸代谢相关CYP2C19基因多态性在癫痫患儿体内的分布及治疗个体化研究

2015-12-21冯亚娟周建华刘科兰吴干斌

中国实用神经疾病杂志 2015年5期

关键词：抗癫痫戊酸血药浓度

冯亚娟周建华刘科兰吴干斌

郑州大学第二附属医院西药学部郑州 450014

丙戊酸代谢相关CYP2C19基因多态性在癫痫患儿体内的分布及治疗个体化研究

冯亚娟周建华刘科兰吴干斌△

郑州大学第二附属医院西药学部郑州 450014

目的对癫痫患儿体内CYP2C19的基因多态性进行研究，并进行基因型与患儿体内丙戊酸血药浓度关系的研究，以对患儿进行治疗个体化。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测技术对2012-12—2014-03来我院及其他医院神经内科654例确诊为癫痫患儿的CYP2C19基因型进行检测，同时对仅服用丙戊酸进行抗癫痫治疗的228例患儿体内的丙戊酸稳态血药浓度进行检测，进而探求CYP2C19的基因型与血药浓度的相关性。结果 CYP2C19具有基因多态性，各基因型分布频率不同，其中＊1/＊1型为41.9％、＊1/＊2型为41.1％、＊1/＊3型为6.4％、＊2/＊2型为7.4％、＊2/＊3型为2.9％和＊3/＊3型为0.3％；同时入选组的228例患儿中快、中、慢代谢型所占的频率分别为40.8％、44.7％和13.5％；同时测得＊1/＊1型、＊1/＊2型、＊1/＊3型、＊2/＊2型、＊2/＊3型所对应的稳态血药浓度（mg/L）分别为45±20、64±16、68±21、73±28、72±18；经统计分析发现，＊2/＊2型与＊1/＊1型血药浓度体质量剂量比值存在差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论癫痫患儿体内CYP2C19具有多态性，其分布规律与其他正常人群的分布规律基本一致，患儿服用丙戊酸时，其CYP2C19基因型与体内丙戊酸的血药浓度具有相关性。因此提醒我们，对癫痫患儿应用丙戊酸进行抗癫痫治疗时，可参考CYP2C19基因分型结果，预测血药浓度变化，对患儿进行个体化的治疗。

CYP2C19；基因多态性；癫痫患儿；丙戊酸；血药浓度

癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征，具有发病率高、疗程长、治愈率低特点。临床治疗中主要以长期合理使用抗癫痫药物为主。小儿癫痫发病率高，可达到2％～7％。

丙戊酸是临床常用的广谱抗癫痫药物，但其血药浓度、疗效和不良反应存在显著的个体差异，因此在临床应用中需要对患者进行血药浓度监测（TDM）。同时在使用过程中发现有“耐药”现象的产生。研究表明，CYP2C19在体内可参与丙戊酸的代谢过程，其多态性会影响到体内血药浓度的高低，进而影响药物的疗效，与“耐药”现象的产生有关［1-4］。本文拟通过对癫痫患儿的CYP2C19基因多态性进行研究，进而探求基因多态性与患儿体内丙戊酸血药浓度的相关性，从而为癫痫患儿提供个体化给药方案。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂 DNA提取及扩增试剂盒，有上海某公司提供；ABI9902型PCR扩增仪，美国AB公司生产；BR526-24型全自动杂交仪，上海某公司生产；BE-2.0型生物芯片识别仪，上海某公司生产；5424R型高速离心机，德国eppendorf公司生产；HYC-260型医用冷藏箱，青岛海尔公司生产；TDX SYSTEM型快速血药浓度检测仪，美国雅培公司生产；其余耗材及试剂均为国产

1.2 研究对象研究对象是2012-12—2014-03来我院及其他医院神经内科确诊为癫痫的654例患儿，均签署知情同意书，汉族，彼此之间无血缘关系。年龄3个月～12岁，男448例，女206例，否认癫痫家族史。入组行基因型和丙戊酸血药浓度相关性研究的患儿（由上述654例患儿中选出）标准是：仅为癫痫患儿，无其他并发症，单独使用丙戊酸，无联合用药，肝肾功能无异常，取血时间为建立稳态血药浓度时；剔除标准为：合并其他病症，存在联合用药现象，肝肾功能异常，取血时间点不规范。入组进行相关性研究的癫痫患儿228例，年龄6个月～12岁，男164例，女64例，平均年龄（5.0±4.1）岁，平均体质量（16.5±11.3）kg，服用丙戊酸的剂量平均值（375±235）mg/d。

1.3 研究方法

1.3.1 提取DNA：取654例癫痫患儿的外周血1mL（EDTA抗凝），提取试剂有上海某公司提供，按照相关操作流程进行DNA提取。

1.3.2 PCR扩增：反应体系25μL：扩增液和反应液共计20 μL，DNA模板5μL；PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；再在72℃条件下延伸5min，扩增产物于4℃冰箱保存备用。

1.3.3 分析CYP2C19基因型：根据基因多态性对药物的代谢能力的强弱，将患者分为三种：弱代谢型（PM，双位点突变型）；中间代谢型（IM，单位点突变型）；强代谢型（EM，野生纯合子型）。其中强代谢型的基因型为＊1/＊1型；中间代谢型的基因型为＊1/＊2和＊1/＊3型；弱代谢型的基因型为＊2/＊2、＊2/＊3和＊3/＊3型［5］。有上海某公司提供的全自动杂交仪将PCR扩增产物进行杂交，应用单碱基延伸结合微阵列芯片法对位点进行检测和测序，最终通过生物芯片识别仪读出CYP2C19（636、681位点）的基因分型。

1.3.4 测定丙戊酸钠血药浓度：228例癫痫患儿服用丙戊酸5个半衰期，体内药物浓度达到稳态后，于下次用药前抽取静脉血，荧光偏振免疫法测定丙戊酸血药浓度。为了避免丙戊酸剂量以及患儿体质量对血药浓度的影响，我们对血药浓度进行了标准化处理：将实验测定的血药浓度除以患者每日每公斤体质量的服药剂量（血药浓度/体质量剂量）。

1.4 统计学分析用统计学软件SPSS 18.0进行统计学分析，利用χ2检验和方差分析对各组进行比较；同时进行Hardy—Weinberg定律的吻合度测验，检验各等位基因频率是否符合遗传学规律［6］；并对基因型和体内血药浓度的相关性进行统计学分析；所有检测均双侧检验，以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型及其分布概率我们对654例癫痫患儿体内CYP2C19的第636位和第681位两个位点碱基的突变进行检测，基因型图示如图1所示，另6种基因型在654例癫痫患儿中的各自分布频率见表1。

图1 CYP2C19各基因型生物芯片识别图

表1 654例癫痫患儿体内CYP2C19各基因型的分布频率

经过统计分析发现等位基因频率在性别间无统计学意义（χ2＝2.76，P＞0.05）。通过计算检测符合Hardy-Weinberg平衡定律，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 入组进行基因型与丙戊酸血药浓度相关性研究 228例癫痫患儿体内CYP2C19各基因型分布频率经过统计分析同样发现等位基因频率在性别间的差异无统计学意义（χ2＝2.35，P＞0.05），同时和654例患者的基因型的分布概率相比，差异无统计学意义。结果见表2。

表2 入组相关性研究的228例癫痫患儿体内CYP2C19各基因型的分布频率

2.3 CYP2C19各基因型与体内丙戊酸血药浓度的关系

由于入选组样本量偏小（仅228例），我们经过整理没有发现＊3/＊3型（636AA，681GG）的患儿，各基因型血药浓度及血药浓度/体质量剂量结果见表3。结果中我们看到＊2/＊2型（636GG，681AA）（突变型）血药浓度体质量剂量比值明显高于＊1/＊1型（636GG，681GG）（野生型），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各基因型与血药浓度的关系

3 讨论

丙戊酸是临床上常用的抗癫痫药物之一，由于它抗癫谱比较广，疗效比较确切，价格比较低廉，因此在小儿癫痫患者中得到了广泛的应用。但在临床中发现服用该药后体内的血药浓度存在很大的个体差异，对于很多患者会出现消化系统、肝脏及血液系统的毒性，甚至出现致死性肝坏死（两岁以下患儿多见）［7］。鉴于个体差异等方面的原因，在使用上述药物进行抗癫痫治疗时需要进行血药浓度监测。

随着药物基因组学的发展，研究发现临床中常用的抗癫痫药物丙戊酸主要经CYP2C19代谢［1，8-90］。CYP2C19又称为S-美芬妥英羟化酶，其存在基因多态性，会导致其活性存在明显的个体差异，影响着很多药物的代谢［10-13］。

我们对654例癫痫患儿体内CYP2C19的第636位（G→A突变）和第681位（G→A突变）两个位点碱基的突变进行研究，结果发现，CYP2C19基因具有多态性，在癫痫患儿中发现有6种基因分型，各基因型分布概率与其他正常人群中的分布概率基本一致［14-16］。在癫痫患儿中，强代谢型（EM）的分布概率为41.9％，中间代谢型（IM）为47.5％，弱代谢型（PM）为10.6％。其中对于强代谢型与文献报道的45.7％为低，中间型与文献报道的38.3％较高，而对于弱代谢型与文献报道的16.0％为低［16］。从本文的结果来看，有58.1％的癫痫患儿体内CYP2C19的基因存在缺陷（发生单突变或双突变），也就是说有近六成的癫痫患儿在服用常规剂量的丙戊酸进行抗癫痫治疗时，会因为血药浓度升高而引起很多方面的不良反应，该数据与一篇文献［17］报道的56.9％接近。

通过研究CYP2C19基因型和患儿体内丙戊酸血药浓度的相关性我们发现，各基因型的患儿体内丙戊酸的血药浓度有很大的差异，各基因型中，野生型的血药浓度最低，高低顺序为＊1/＊1型（636GG，681GG）＜＊1/＊2型（636GG，681GA）＜＊1/＊3型（636GA，681GG）＜＊2/＊3型（636GA，681GA）＜＊2/＊2型（636GG，681AA）。而血药浓度/体质量剂量的顺序为＊1/＊1型（636GG，681GG）＜＊2/＊3型（636GA，681GA）＜＊1/＊2型（636GG，681GA）＜＊1/＊3型（636GA，681GG）＊2/＊2（636GG，681AA），这与文献报道的相一致［17-20］。结果与国内外研究CYP2C19基因突变后血液中抗癫痫药物如丙戊酸、苯巴比妥、苯妥英的浓度均会升高的结论是一致的。由于入组的样本量较小，我们只发现了五种基因型，而未发现＊3/＊3型（636AA，681GG）。鉴于初步的研究结果，我们下一步拟对癫痫患儿的体质量剂量和血药浓度分阶段进行比较，并扩大样本量进行试验，以期获得基因型和血药浓度之间更为确切的相关性。

从本实验的结果来看，服用标准剂量的丙戊酸后弱代谢型和中间代谢型患儿的丙戊酸血药浓度均高于强代谢型患儿，这就提示我们在对患儿进行抗癫痫治疗之前可以对患儿CYP2C19基因型进行检测，对于CYP2C19基因型存在突变的癫痫患儿，可以使用较小剂量的丙戊酸，以期达到控制癫痫发作同时减少不良反应发生的目的，进而为癫痫患儿实现真正意义上的个体化用药。

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