应用Illumina高通量测序技术探究长根菇多糖对小鼠肠道菌群的影响

王 雪，赵龙玉，赵凤春，张圣方，杨正友

（山东农业大学生命科学学院，山东省农业微生物重点实验室，山东 泰安 271018）

应用Illumina高通量测序技术探究长根菇多糖对小鼠肠道菌群的影响

王 雪，赵龙玉，赵凤春，张圣方，杨正友*

（山东农业大学生命科学学院，山东省农业微生物重点实验室，山东 泰安 271018）

本研究采用Illumina高通量测序技术检测长根菇多糖对昆明小鼠肠道菌群的影响。利用盐酸林可霉素灌胃建立肠道微生态失调小鼠模型。将60 只小鼠随机分为5组：空白对照组、自然恢复组、长根菇多糖低剂量组、长根菇多糖中剂量组和长根菇多糖高剂量组。无菌条件下采集小鼠盲肠内容物，运用Illumina高通量测序技术分析各组小鼠盲肠内容物中菌群的结构。结果表明：空白对照组小鼠肠道菌群物种多样性最高，长根菇多糖各剂量组次之，自然恢复组最低；另外，各组小鼠肠道有益菌与致病菌比例差异显著，长根菇多糖各剂量组有益菌群相对比例高于自然恢复组，而自然恢复组小鼠肠道中致病菌比例最高。长根菇多糖对小鼠的肠道菌群失调具有恢复和改善作用。

长根菇；多糖；肠道菌群；高通量测序

长根菇（Oudemansiella radicate），又名长根小奥德蘑、长根金钱菌，隶属于真菌界，担子菌门，伞菌纲，伞菌目，膨湖菌科，小奥德蘑属[1]。其子实体肉质鲜嫩，味美可口。长根菇的子实体、菌丝体及菌丝体发酵液中含有多种药用成分，有益于人体健康，如长根菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤[2]、降低机体胆固醇含量及防止动脉硬化[3]的作用，而长根菇素有降压[4]等功效。长根菇作为一种食药两用的名贵真菌，具有巨大的开发潜力。

在人和动物体内，肠道正常微生物平衡、肠黏膜上皮屏障以及肠道免疫系统为正常肠道屏障功能提供了保障[5]。数量庞大的肠道菌群对宿主具有营养、免疫和生物拮抗等作用[6]。盐酸林可霉素（lincomycin hydrochloride，LIH）是临床常用抗菌药物，对大多数革兰氏阳性细菌有较强的抑制作用[7]。现今，抗菌药物使用不当已经成为引起肠道菌群失调的最常见诱因[8]。抗菌药物对肠道菌群的影响主要表现在敏感菌被大量杀死，而耐药菌大量繁殖，比例超出正常水平，各种菌群大幅度变化，特别是原籍菌群数量和密度下降，而外籍菌和环境菌群数量和密度升高[9]。近年来的研究发现，真菌多糖具有改善动物体内肠道微生态的作用[10]。

肠道微生物研究的主要障碍是肠道菌群的鉴定技术，早期肠道菌群的研究主要建立在传统培养技术的基础上[11-12]。传统培养技术准确率低、局限性大，只能检测培养型微生物[13]，而大多数的肠道菌群为非培养型菌[14]，培养型细菌只占肠道菌群的1%～10%[15]。近年来，分子生物学技术在微生物群落分析上的应用愈加广泛，包括荧光原位杂交[16]、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）[17]、实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[18]、构建克隆文库[19]等。然而这些传统分子生物学技术具有其局限性，不能完整地反映整个群落的结构信息，且耗时长、工作量大。与之相比，高通量测序技术对微生物群落信息的采集与分析更准确、详细[20]。高通量测序技术在肠道微生物的研究中已有应用，它使研究人员对肠道菌群的构成有了更加全面的认识。

本实验使用盐酸林可霉素构建肠道菌群失调小鼠模型，对小鼠进行长根菇多糖灌胃实验，采用Illumina高通量测序技术对小鼠肠道菌群进行研究，探究长根菇多糖对肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与动物

长根菇购自四川省绵阳市食用真菌研究所。

盐酸林可霉素注射液（300 mg/mL） 河南福森药业有限公司；土壤基因组DNA提取试剂盒 美国Omega生物技术公司；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒美国Axygen公司。

清洁级雄性昆明小鼠，体质量（20±2） g，由泰山医学院动物实验中心提供。小鼠饲养环境保持室温（25±1） ℃，相对湿度（55±10）%，灯光控制12 h昼夜交替。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；TGL-16B型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；WSZ-160A型漩涡振荡器 上海一恒科技有限公司；K5600超微量核酸蛋白检测仪 北京凯奥科技发展有限公司；751G型紫外分光光度计 美国Amersham Biosciences公司；QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统 美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 长根菇多糖的制备

菌种活化后接种于液体培养基，26 ℃、160 r/min摇瓶培养7 d后，3 600 r/min离心去除菌丝体，收集发酵液。将获得的发酵液采用乙醇沉淀法提取粗多糖。粗多糖依次经Sevag法脱蛋白、活性炭除色素、透析除小分子杂质，最终得到精制的长根菇胞外多糖。用苯酚-硫酸法[21]对长根菇多糖进行定量测定。

1.3.2 动物分组、造模和给药

从60 只清洁级雄性昆明小鼠中随机取出12 只作为空白对照组，剩余48 只用盐酸林可霉素（300 mg/mL）灌胃造模，每次0.3 mL，2 次/d，连续灌胃3 d。以小鼠出现溏便、背毛失去光泽、行动迟缓为造模成功的标准。空白对照组小鼠灌胃相同体积的生理盐水。造模成功后，将模型组小鼠随机均分为4 组：自然恢复组、3 个不同剂量长根菇多糖组。饲养期间，供给充足的饲料和饮水供小鼠自由摄取。按照表1的方案，每天使用生理盐水或不同质量浓度长根菇多糖溶液对小鼠进行定时灌胃，连续灌胃14 d。

表1 小鼠分组和给药方案Table 1 Animal grouping and drug administration of experimental mice

1.3.3 样品采集

最后一次灌胃24 h后处死小鼠，将小鼠固定于解剖板，常规消毒，正中剖开腹腔，无菌收集回盲部末端10 cm以内的盲肠内容物，置于干燥的灭菌试管中。

1.3.4 肠道菌群DNA提取和Illumina高通量测序

分别取5 个盲肠内容物的粪便样本，采用土壤基因组DNA提取试剂盒提取小鼠粪便样品微生物的总DNA，具体步骤按说明书操作。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。所提取的DNA于－20 ℃保存备用。由上海美吉生物医药科技有限公司对样品进行16S rRNA基因V4区的PCR扩增及Illumina高通量测序。

针对16S rRNA基因V4区，合成带有barcode的特异引物。PCR扩增采用TransGen AP221-02: TransStartFastpfu DNA聚合酶反应体系。每个样品3 个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量，之后进行相应比例的混合。测序得到的PE reads（paired-end reads）首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样品后利用Mothur软件对序列进行OTU聚类，用于样品间的相似性分析，并绘制样品的稀疏曲线，计算样品的alpha多样性。Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括ACE值、Chaol值、Shannon指数等。Chaol值和ACE值是根据所测得的OTU数量预测样品中微生物的种类，Shannon指数是一个多样性指数，Shannon指数越大，则表示该样品中的物种越丰富。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计分析，显著性分析采用单因素方差分析，显著水平α=0.05，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 长根菇多糖提取结果

依据苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线，得到标准曲线方程为y = 0.013x－0.003，根据标准曲线方程计算经脱蛋白、脱色素、透析除小分子后，精制的长根菇多糖纯度为79.71%。

2.2 小鼠肠道菌群物种丰度及多样性

表2 各组小鼠肠道菌群的OTU数量及alpha多样性Table 2 OTU number and alpha diversity of intestinal microbiota in different groups of mice

利用Mothur软件计算在97%的相似水平上每个样品的OTU数量，OTU数量可以代表样品物种的丰度[22]。由表2可知，在所有样品中，OTU数量最多可达到290，最少为199。这表明小鼠盲肠内容物中微生物的丰度很高，并且样品之间微生物丰度差异较大。同时alpha多样性分析也表明，空白对照组多样性指数最优（ACE值和Chaol值最高，Shannon指数最低），自然恢复组ACE值和Chaol值最低，这说明给小鼠灌胃长根菇多糖后，其肠道微生物多样性高于自然恢复组但低于空白对照组，且长根菇多糖中剂量组小鼠肠道菌群丰度在长根菇多糖各剂量组中最高。Alpha多样性指数ACE值、Chaol值及Shannon指数在空白对照组、自然恢复组和长根菇多糖中剂量组之间差异显著（P＜0.05）。

图1 肠道菌群的稀疏曲线Fig.1 Rarefaction curve analysis of intestinal microfl ora

由图1可知，当测序数据量相同时，长根菇多糖各剂量组小鼠的肠道菌群OTU数量比空白对照组低，但高于自然恢复组，长根菇多糖中剂量组小鼠的肠道菌群OTU数量高于另外两个长根菇多糖组，表明长根菇多糖各剂量组小鼠的肠道菌群多样性低于空白对照组但高于自然恢复组，长根菇多糖中剂量组小鼠的肠道菌群多样性在长根菇多糖各剂量组中最高，说明盐酸林可霉素对小鼠肠道菌群产生了影响，长根菇多糖对小鼠的肠道菌群失调有恢复作用，且中剂量长根菇多糖效果最好。

2.3 小鼠肠道菌群结构分析

图2 小鼠肠道菌群在门水平上的相对丰度Fig.2 Relative abundance of mouse intestinal microflora at the level of phylum

通过对所有样品中微生物的16S rRNA基因V4区序列进行Illumina测序，共检测到8 个菌门。其中所有样品88.95%以上都是由厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）组成。由图2可知，自然恢复组的小鼠肠道中拟杆菌门含量最高、厚壁菌门含量最低，在肠道菌群中所占的相对比例分别为64.87%和29.67%；长根菇多糖各剂量组的小鼠肠道中拟杆菌门含量均低于空白对照组，且随着多糖剂量的增大而降低，其中长根菇多糖高剂量组的小鼠肠道中拟杆菌门含量相对空白对照组降低了15.64%，长根菇多糖各剂量组的小鼠肠道中厚壁菌门含量均高于空白对照组且与多糖剂量成正比，其中长根菇多糖高剂量组的小鼠肠道中厚壁菌门含量相对空白对照组升高了7.39%。

对小鼠肠道菌群在纲的水平和属的水平进行深入分析，能更清晰地得出各组小鼠肠道中有益菌和有害菌的变化趋势。芽孢杆菌纲（Bacilli）在自然恢复组小鼠肠道菌群中含量最低，在长根菇多糖高剂量组小鼠肠道菌群中含量最高，所占的比例分别为8.29%和14.68%，且随长根菇多糖剂量升高有上升趋势。自然恢复组小鼠肠道菌群中梭菌纲（Clostridia）含量相对于空白对照组提高了85.94%，长根菇多糖中、低剂量组小鼠肠道菌群中梭菌纲含量低于空白对照组。Allobaculum属、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳杆菌属（Lactobacillus）在自然恢复组小鼠肠道菌群中含量最低，其中双歧杆菌属和乳杆菌属含量分别低于空白对照组79.96%和39.54%，而在长根菇多糖各剂量组小鼠肠道菌群中含量均有较大程度提高，双歧杆菌属在长根菇多糖低、中剂量组小鼠肠道菌群中含量已恢复至空白对照组水平，乳杆菌在长根菇多糖各剂量组小鼠肠道菌群中含量均已恢复至空白对照组水平，在长根菇多糖高剂量组小鼠肠道菌群中含量高于空白对照组。在自然恢复组小鼠肠道菌群中未检测到瘤胃球菌属（Ruminococcus），其余4 组中均含有此菌群。脱硫弧菌属（Desulfovibrio）在长根菇多糖中剂量组小鼠肠道菌群中含量最低，低于空白对照组48.89%。

3 讨 论

正常微生物菌群[23]大量栖居于健康动物的体表和体内，与宿主机体之间处于一种动态平衡状态，与此同时，不同菌群之间也保持着一定的比例关系，菌群的平衡与稳定对机体的各项生理功能具有重要的影响，例如它们在营养消化吸收、免疫拮抗等方面发挥着重要作用[24]。抗菌药物在征服感染的斗争中发挥了巨大的作用，但是它所带来的危害也不容小觑，其主要副作用之一就是对肠道微生态的影响，破坏了正常的微生物菌群平衡，使得原来呈弱势的致病菌含量上升，继而出现腹泻等一系列问题。Illumina高通量测序技术又称为新一代测序技术，是一种采用专有的可逆终止子化学方法对数百万片段进行大规模测序的新型测序技术[13]。该技术是目前应用于肠道微生物研究的前沿技术。

本研究通过Illumina测序技术检测小鼠粪便中微生物组成和结构，发现不同样品中物种丰度存在差异，不同组小鼠肠道菌群的变化呈现一定规律。Bezirtzoglou 等[25]的研究结果显示在人类肠道中的优势菌群分别是Bacteroidetes和Firmicutes这2 个细菌门，本实验中小鼠肠道优势菌群研究结果与其一致。肠道菌群多样性分析表明，空白对照组小鼠肠道菌群多样性最高，其次为长根菇多糖中剂量组，自然恢复组最低，说明抗生素的使用降低了小鼠肠道菌群的多样性，而长根菇多糖对小鼠肠道菌群的恢复具有显著作用，但这种恢复作用并不是随着多糖剂量的增大而升高，中剂量长根菇多糖的恢复作用最好。本研究发现，自然恢复组小鼠肠道菌群中拟杆菌门含量最高，而长根菇多糖各剂量组小鼠肠道菌群拟杆菌门含量低于空白对照组。厚壁菌门含量随长根菇多糖剂量增大而升高，自然恢复组最低。芽孢杆菌纲、Allobaculum属、双歧杆菌属、乳杆菌属和瘤胃球菌属等在自然恢复组小鼠肠道菌群中含量最低，在长根菇多糖各剂量组小鼠肠道菌群中则均有较大程度提高，甚至超过空白对照组含量。梭菌纲和脱硫弧菌属在自然恢复组小鼠肠道菌群中含量最高，长根菇多糖组小鼠肠道菌群中梭菌纲和脱硫弧菌含量则接近或低于空白对照组。小鼠肠道中的拟杆菌门主要为拟杆菌纲（Bacteroidia），有时能够成为病原菌，引起阑尾炎或败血症等病症。厚壁菌门在肠道中能够帮助多糖发酵，芽孢杆菌纲是厚壁菌门的一纲，包含有芽孢杆菌目和乳杆菌目2 目，其下包含有芽孢杆菌属等革兰氏阳性菌，在维持动物肠道健康中起重要作用。Allobaculum属具有肠道保护功能，瘤胃球菌属能够帮助肠道消化吸收糖类。在自然恢复组小鼠肠道菌群中含量明显多于其他组的梭菌纲能够引起院内感染相关的致病菌定殖，另一种脱硫弧菌属则是能够产内毒素的肠道致病菌。

本研究结果显示，长根菇多糖能够增加小鼠肠道菌群的丰度，并且对使用抗生素造成的肠道菌群紊乱具有调整恢复作用，在一定程度上增加有益菌群的数量，抑制致病菌的生长。

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Effect of Oudemansiella radicate Polysaccharide on Intestinal Microbiota in Mice Evaluated by Illumina High-Throughput Sequencing

WANG Xue, ZHAO Longyu, ZHAO Fengchun, ZHANG Shengfang, YANG Zhengyou*
(Shandong Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

The effect of Oudemansiella radicate polysaccharide (ORP) on the intestinal microbiota in Kunming male mice was studied by Illumina high-throughput sequencing in this investigation. The mouse model of intestinal dysbiosis was established by intragastric administration of lincomycin hydrochloride. Sixty mice were randomly divided into fi ve groups including normal control group, natural recovery group and three groups treated with Oudemansiella radicate polysaccharide at different doses. Cecal contents were collected aseptically, and the intestinal microbiota was detected by illumina highthroughput sequencing. The results showed that the diversity and abundance of intestinal bacteria were varied in the mice in the fi ve groups. Among these, the normal control group had the highest intestinal microbiota diversity followed by the ORP treatment groups, and the intestinal microbiot a of the natural recovery group exhibited the lowest species diversity. In addition, the proportions of benefi cial and pathogenic bacteria in the mouse intestine differed signifi cantly among the fi ve groups; the proportion of benefi cial bacteria was higher in the three treatment groups than in the two other groups and the highest proportion of pathogenic bacteria was observed in the natural recovery group. indicating that Oudemansiella radicate polysaccharide could improve and recover the intestinal microbiota of mice with intestinal dysbiosis.

Oudemansiella radicate; polysaccharide; intestinal microbiota; high-throughput sequencing

Q507

A

1002-6630（2015）19-0222-05

10.7506/spkx1002-6630-201519040

2014-11-18

国家自然科学基金面上项目（30972050；31271873）；山东省自然科学基金项目（ZR2010CM015）

王雪（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。E-mail：luoxueqingchen@163.com

*通信作者：杨正友（1971-），男，教授，博士，研究方向为食品质量与安全、食品微生物学。E-mail：zhyou21cn@sdau.edu.cn