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发酵肉制品中组胺含量测定方法的比较

2015-12-20王新惠李俊霞

食品与机械 2015年3期
关键词:组胺肉制品国标

王新惠 白 婷 李俊霞,2 罗 静

(1.成都大学生物产业学院肉类加工四川省重点实验室,四川 成都 610106;2.西华大学生物工程学院,四川 成都 611743)

发酵肉制品由于富含蛋白质和氨基酸,在成熟、贮藏过程中,游离组氨酸易在氨基酸脱羧酶的作用下生成组胺。组胺是生物胺中毒性最强,对人体健康危害最大的一种生物胺。它是一种过敏性物质,会引起毛细血管扩张和支气管收缩,导致患者头疼、头晕、胸闷、全身乏力和烦躁等。此外,组胺与亚硝酸盐反应可能形成致癌性物质N-亚硝胺[1]。研究[2]表明,发酵香肠、腊肉等发酵肉制品含有较高浓度的组胺,随机抽检四川、重庆、江西、北京、江苏、浙江以及广东等不同地区的42个传统发酵香肠样品,组胺均有不同程度的检出。据报道[3],2002~2012年中国约发生140起食品组胺中毒事件。食品中组胺成为世界范围公认的、潜在的食品安全问题,已成为食品安全研究的热点。目前,发酵肉制品及其它种类肉制品中组胺的限量还没有明确的规定,中国一般要求低于100mg/kg,FDA规定食品中生物胺总量不得超过1 000mg/kg,其中组胺含量≤50mg/kg,欧盟对肉制品中组胺要求≤100mg/kg[4-7]。因此,建立准确的测定发酵肉制品中组胺的分析方法有着非常重要的意义。

目前,中国测定食品中的组胺,主要采用中国GB/T 5009.45—2003《水产品卫生标准的分析方法》(文中简称中国国标法),而该法主要用于检测水产品中的组胺含量[8,9]。发酵肉制品蛋白质、油脂含量较高,中国国标法中规定的样品前处理方法对发酵肉制品已不适宜。本研究分别采用液相色谱法、中国国标法和中国国标改进法3种方法测定香肠、腊肉等传统发酵肉制品中的组胺,比较这3种方法的精密度和准确度,旨在探讨3种方法的优劣,寻找一种较准确且适合测定发酵肉制品中组胺的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要试剂

正戊醇、三氯乙酸溶液、碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、氨基苯胺、亚硝酸钠、酚酞、乙酸铵、高氯酸、碳酸氢钠:分析纯,北京化学试剂公司;

组胺标物:纯度≥97%,国药集团化学有限公司;甲醇:色谱纯,天津康科德科技有限公司;

丹酰氯:纯度≥99.0%,上海沪鼎生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

可见紫外分光光度计:UV741型,惠普上海分析仪器有限公司;

电子天平:JA2003型,上海天平仪器厂;

高速冷冻离心机:CR22G型,日立工机株式会社;

超声波细胞破碎仪:JY92-11N型,宁波新芝生物技术股份有限公司;

高效液相色谱:Agilent1100型,安捷伦科技有限公司;

均质器:ZQ-Ⅱ型,天津市东康科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组胺标准储备液的制备 准确称取(100±5)℃干燥2h的组胺磷酸盐0.276 7g溶于蒸馏水中,转入100mL容量瓶中,定容,此溶液组胺浓度为1.0mg/mL。组胺标准使用液配制:准确吸取1.0mL组胺标准储备液置于50mL容量瓶中定容,此溶液组胺浓度20.0μg/mL。

1.2.2 中国国标法测定组胺 按GB/T 5009.45—2003《水产品卫生标准的分析方法》执行。

1.2.3 中国国标改进法测定组胺 根据 GB/T 5009.45—2003修改如下:称取5.00g样品,置于具塞锥形瓶中,加入三氯乙酸溶液20mL,超声处理(功率300W,温度45℃)2 min后,于4℃以6 000r/min离心5min。上清液稀释100倍后取2.0mL于10mL离心管中,加入1滴酚酞指示剂(10g/L),逐滴滴加氢氧化钠溶液(250mg/mL)呈碱性(溶液刚呈红色),每次加入正戊醇3mL,旋涡振荡2min后,于4℃以2 000r/min离心5min,提取3次,合并正戊醇提取液并稀释至10.0mL,备用。取1.0mL盐酸提取液于10 mL比色管中,加3mL碳酸钠溶液,3mL偶氮试剂,加水至刻度,旋涡振荡2min,静置10min后,480nm处测定吸光值并计算结果。

1.2.4 液相色谱法测定组胺 根据文献[10]和[11]修改如下:称取5.00g样品,置于具塞50mL离心管中,加入0.4mol/L高氯酸溶液10mL,均质1min后,于4 ℃以6 000r/min离心5min。上清液稀释100倍取2.0mL置于10 mL离心管中,依次加入2mol/L氢氧化钠100μL,饱和碳酸氢钠300μL和10mg/mL丹酰氯溶液(溶于丙酮)1mL,盖塞。40℃避光反应45min后,加入浓氨水100μL终止反应。加入乙腈使终体积为5mL,0.20μm滤膜过滤,供高效液相色谱测定。色谱测定条件[2]:检测波长254nm,柱温35℃,进样量50μL,流动相A为水,流动相B为乙腈,用30%A和70%B的混合液平衡、洗脱,流速0.3mL/min。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

2.1.1 中国国标法和中国国标改进法的标准曲线 准确吸取0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL组胺标准使用液分别置于6支10mL比色管中,加水至1mL。再各加1mL盐酸(1+11),3mL碳酸钠溶液,3mL偶氮试剂,加水至刻度,混匀,放置10min,用1cm比色杯以零管调节零点,480nm测吸光值,绘制标准曲线见图1。

2.1.2 高效液相色谱法的标准曲线 准确吸取0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL组胺标准使用液,依次加入2mol/L氢氧化钠溶液100μL,饱和碳酸氢钠溶液300μL和10mg/mL丹酰氯溶液1mL,盖塞。40℃避光反应45min后,定容至5 mL,振荡均匀,0.20μm滤膜过滤,液相色谱测定,绘制标准曲线见图2。

由图1、2可知,组胺浓度在0~20μg/mL范围内中国国标法、中国国标改进法和液相色谱法都呈现良好的线性关系,曲线相关系数都在0.99以上,其中液相色谱法更为灵敏。

图1 分光光度法组胺标准曲线Figure 1 Histamine standard curve of spectrophotometric method

图2 液相色谱法组胺标准曲线Figure 2 Histamine standard curve of liquid chromatography method

2.2 中国国标法、中国国标改进法和液相色谱法的精密度和准确度

以某品牌的鲜肉、川味发酵香肠、广味发酵香肠和发酵腊肉为试验材料,加入一定量的组胺标准品使加标值达到20 mg/kg,分别采用中国国标法、中国国标改进法和液相色谱法测定样品中的组胺含量,比较3种方法的精密度和准确度。每个试样做6次平行检测,数据采用 Matlab ver.2006 b(Mathworks Inc.,Natick,MAUS)和 Microsoft Excel(Microsoft,Redmond,Washington,US)分析,结果见表1、2。

表1 中国国标法、中国国标改进法和液相色谱法的精密度Table 1 Results of precision test of liquid chromatography method,the national standard method and the improved national standard method(n=6)

表2 中国国标法、中国国标改进法和液相色谱法的准确度Table 2 Results of accuracy test of liquid chromatography method,the national standard method and the improved national standard method(n=6)

由表1、2可知,高效液相色谱法的精密度最高,稳定性好,其相对标准偏差<1%,而中国国标法的精密度最差,重复性较差,波动较大,其相对标准偏差接近5%。液相色谱法和中国国标改进法测定肉制品中组胺的回收率均高于90%以上,优于中国国标法,准确度满足试验要求。卢士玲[12]、张海萍[13]等报道采用液相色谱法测定发酵肉制品中组胺,灵敏度高,重复性好,准确度高,优于中国国标法。液相色谱设备和耗材昂贵,且其前处理步骤比较繁琐,需要经过提取后才可衍生进样,因此,液相色谱法具有一定局限性。中国国标法中所需仪器设备一般实验室都具备,且测定费用比较低廉,因此,目前中国国标法仍是中国检测人员测定肉制品中组胺的主要方法之一。笔者在实际测定过程中发现,发酵肉制品蛋白质、油脂含量较高,中国国标法中采用提取剂常温浸泡处理样品,样品中的组胺未充分进入到提取剂中,提取率较低,导致测得数据比真实值偏小;中国国标法中采用分液漏斗分离提取液,样品中的蛋白质和油脂与提取液不易分层,分离提取液易混入肉泥、蛋白质等杂质影响样品吸光值准确度[14]。笔者在中国国标法的基础上进行改进:采用超声波辅助萃取取代了中国国标法中室温浸泡2~3h,改进后回收率提高5%,耗时2min,大大缩短提取时间;正戊醇提取过程中,用离心方式取代了中国国标法中用分液漏斗振荡分离的方式,液相与固相实现良好分层,分离提取液无肉泥、蛋白质等杂质混入,增强了测定的稳定性。结果表明,中国国标改进法,呈现出较好的精密度和准确度,能满足测定发酵肉制品中组胺试验要求,是一种准确、经济测定发酵肉制品中组胺的方法。由此可见,试验人员可根据实际条件和需要选择液相色谱法或中国国标改进法对发酵肉制品中的组胺进行测定。

3 结论

分别采用液相色谱法、中国国标法和中国国标改进法等3种方法测定发酵肉制品中组胺,液相色谱法的精密度最高,相对标准偏差<1%,中国国标法的精密度最差,相对标准偏差接近5%。笔者采用超声波辅助萃取取代了中国国标法中室温浸泡2~3h,用离心方式取代了中国国标法中用分液漏斗振荡提取的方式,改进后回收率提高5%,提取液中无肉泥、蛋白质等杂质增强测定的稳定性,呈现出较好的精密度和准确度。液相色谱法和中国国标改进法均能满足测定发酵肉制品中组胺的试验要求。

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