枸橼酸钠粉剂抗凝管的制备及其应用评价

华建江，何维娜，杜纪坤，梁巧玲，徐志康，黄江浩，钟 瑜

枸橼酸钠粉剂抗凝管的制备及其应用评价

华建江，何维娜，杜纪坤，梁巧玲，徐志康，黄江浩，钟 瑜

目的：制备并评价枸橼酸钠粉剂抗凝管在纠正乙二胺四乙酸（EDTA）依赖性假性血小板减少症（EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）中的应用效果。方法：取109 mmol/L枸橼酸钠三钠溶液至玻璃管经56℃烘干制成各含量的粉剂抗凝管，用仪器法、光学法、手工法和染色法检测238例不同抗凝剂标本的血小板（PLT）结果，分析其与枸橼酸钠水剂、肝素标本抗凝效果的异同。结果：50例正常人12.8 mg含量枸橼酸钠粉剂抗凝标本的PLT接近EDTA-K2标本结果，差异无统计学意义；采血量为200～600 μL时，枸橼酸钠粉剂标本的PLT与EDTA-K2标本结果差异无统计学意义；除白细胞（WBC）外，枸橼酸钠粉剂标本的PLT、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）与EDTA-K2标本结果相一致（P＞0.05）；28例EDTA-PTCP患者枸橼酸钠粉剂、枸橼酸钠水剂、肝素抗凝标本的PLT分别为（193.89± 50.62）×109/L、（164.86±48.11）×109/L和（108.79±29.33）×109/L，与手工法结果（199.14±47.99）×109/L相比，前者差异无统计学意义（P＞0.05），后两者差异有统计学意义（P＜0.01）；枸橼酸钠粉剂抗凝标本24 h内PLT结果稳定，镜下未见血小板聚集现象。结论：自制枸橼酸钠粉剂抗凝管的最佳抗凝含量为12.8 mg/管，最佳采血量为200～600 μL，在纠正EDTA-PTCP中效果优于枸橼酸钠水剂抗凝管和肝素抗凝管。

枸橼酸钠；干粉；EDTA依赖性假性血小板减少症

0 引言

乙二胺四乙酸（EDTA）依赖性假性血小板减少症（EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）在近几年屡见报道，其发生率（0.07%～0.20%）[1-2]虽然不高，但EDTA-PTCP一旦出现，极易导致临床误诊误治，存在较大的医疗风险。用枸橼酸钠真空抗凝管采血行血小板计数是纠正EDTAPTCP的有效方法之一，然而此管所含抗凝剂为0.3 mL的枸橼酸钠溶液，占3 mL静脉血总体积的10%，用其采血计数血小板必然导致结果偏低，且无法应用于静脉采血困难的婴幼儿EDTA-PTCP的排查。为解决上述问题，本研究将制备出的枸橼酸钠粉剂抗凝管应用于临床，尝试确定其最佳抗凝浓度，并探讨其在纠正EDTA-PTCP中的实际应用效果。

1 材料与方法

1.1 标本资料

所有标本均来自2012年1月至2013年12月深圳市宝安区沙井人民医院住院及门诊患者，分为正常对照组、血小板（PLT）增多组、真性PLT减少组和EDTA-PTCP组。

1.1.1 正常对照组

为体检健康且无血小板相关疾病的志愿者150例，其中男78例，女72例，年龄19～71岁。

1.1.2 PLT增多组

随机选取PLT＞300×109/L患者30例，其中男16例，女14例，年龄3～68岁。

1.1.3 真性PLT减少组

为疾病原因引起的血小板减少（EDTA盐抗凝和枸橼酸盐抗凝血标本测得的血小板均减少）。随机选取PLT＜100×109/L患者30例，其中男13例，女17例，年龄4～65岁。

1.1.4 EDTA-PTCP组

定义为EDTA盐抗凝血中EDTA诱导血小板中的特殊蛋白使血小板发生凝集，且在全自动血细胞计数仪上检测时，其血小板计数发生假性减少（涂片镜检可见血小板聚集、经更换不同抗凝剂重测血小板计数正常、患者无出血倾向）的现象。2 a共检出28例EDTA-PTCP患者，其中男17例、女11例，年龄4个月～72岁（4个月～1岁6例，其余22例为成人）。疾病分布为恶性肿瘤8例、上呼吸道感染5例、血小板减少3例、晚期妊娠2例、贫血3例、手外伤1例、高血压1例、电击伤1例、肺炎1例、体检3例。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂

Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪及其原装试剂、质控品和校准品（日本希森美康公司）；血细胞计数板（江苏海门市天龙实验器材厂）；CX31显微镜（日本Olympus公司）；101-1型电热鼓风干燥箱（江苏通州凌云电器厂）；枸橼酸钠三钠（Na3C6H5O7· 2H2O，分析纯，上海试剂一厂）；草酸铵（北京化学试剂公司），草酸铵稀释液按照第3版《全国临床检验操作规程》配制；瑞氏-吉姆萨染色液（珠海贝索公司）；EDTA-K2真空抗凝管（深圳美瑞公司）；肝素锂真空抗凝管（广州阳普公司）；枸橼酸钠真空抗凝管（或称枸橼酸钠水剂抗凝管，美国BD公司）。

1.2.2 枸橼酸钠粉剂抗凝管的制备

准确称取分析纯的枸橼酸钠三钠（Na3C6H5O7· 2H2O）16 g完全溶于500 mL的蒸馏水中，配制成109 mmol/L的枸橼酸钠溶液，分别取200、300、400、500 μL溶液加于一批干燥、洁净的玻璃小试管内（每管分别含6.4、9.6、12.8、16.0 mg枸橼酸钠），置于101-1型电热鼓风干燥箱56℃、数小时均匀烘干后备用。

1.2.3 仪器法

在使用Sysmex配套试剂且室内质控在控的基础上，将Sysmex XE-2100、XS-1000i分析仪全血细胞的计数结果校准到差异无统计学意义，严格按仪器操作规程对静脉采血标本（血量＜300 μL用XS-1000i，≥300 μL用XE-2100）进行全血细胞计数。

1.2.4 光学法

光学法是用Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪的网织红计数通道进行血小板计数的方法。其原理是用半导体激光加荧光染料染色血小板后仪器可准确计数血小板。此法在很大范围内与卫生部行业标准规定的流式细胞仪计数血小板的参考方法相关性良好[3]，因此，本研究将光学法的血小板计数结果作为确定枸橼酸钠粉剂抗凝管最佳抗凝含量及最佳采血量的参考值。

1.2.5 手工法

采集新鲜指血20 μL，加入加有0.38 mL草酸铵稀释液的试管中，充分混匀，注入血细胞计数板内，静置15 min后，置于显微镜下目视计数PLT。血小板手工计数由本室工作经验超过8 a且具有中级以上技术职称的技术人员严格按照操作规程进行，每份标本计数2次（误差控制在5%以内），结果取其均值。将此结果作为EDTA-PTCP患者PLT计数的参考值。

1.2.6 染色法

用EDTA-K2、枸橼酸水剂和枸橼酸粉剂抗凝标本制成血涂片，待其自然干燥后，进行瑞氏-吉姆萨染色，在显微镜下观察抗凝5 min、2 h、24 h后血小板形态和聚集情况。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料数值用±s表示，组间比较采用配对样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 枸橼酸钠粉剂抗凝管最佳抗凝浓度的确定

早上空腹采集50例正常人静脉血，加入4种含量（6.4、9.6、12.8、16.0 mg）的枸橼酸钠粉剂抗凝管（0.4 mL/管）和EDTA-K2真空抗凝管（2 mL/管），充分混匀，用仪器法检测枸橼酸钠粉剂抗凝管标本的PLT，用光学法检测EDTA-K2抗凝标本的PLT。以光学法结果为PLT的参考值，找到与光学法结果差异无统计学意义的那组枸橼酸钠粉剂抗凝管相应浓度为其最佳抗凝浓度，结果见表1。

表1 不同浓度枸橼酸钠粉剂抗凝管与EDTA-K2抗凝管PLT计数结果比较（±s）

表1 不同浓度枸橼酸钠粉剂抗凝管与EDTA-K2抗凝管PLT计数结果比较（±s）

抗凝管种类 n PLT（×109/L） t P EDTA-K2真空抗凝管 50 271.89±85.55 6.4 mg枸橼酸钠粉剂抗凝管 50 235.82±89.95 -3.031 9.6 mg枸橼酸钠粉剂抗凝管 50 246.67±94.53 -2.624 12.8 mg枸橼酸钠粉剂抗凝管 50 274.64±88.62 -0.794 16.0 mg枸橼酸钠粉剂抗凝管 50 252.47±93.57 -2.406 0.013（＜0.05）0.026（＜0.05）0.450（＞0.05）0.038（＜0.05）

由表1可见，枸橼酸钠粉剂抗凝管的最佳抗凝浓度为12.8 mg/管。

2.2 枸橼酸钠粉剂抗凝管标本最佳采血量范围的确定

早上空腹采集50例正常人静脉血，分别加100、150、200、300、400、500、600、700、800 μL至12.8 mg/管的枸橼酸钠粉剂抗凝管，另加2 mL至EDTA-K2真空抗凝管，充分混匀，用仪器法在Sysmex XS-1000上检测枸橼酸钠粉剂抗凝血标本PLT，用光学法检测EDTA-K2抗凝标本的PLT。找到与光学法PLT结果差异无统计学意义的那组采血量为粉剂抗凝管的最佳采血量，结果见表2。由表2可见，枸橼酸钠粉剂抗凝管标本的最佳采血量为200～600 μL。

表2 不同采血量枸橼酸钠粉剂抗凝管与EDTA-K2抗凝管PLT计数结果比较（±s）

表2 不同采血量枸橼酸钠粉剂抗凝管与EDTA-K2抗凝管PLT计数结果比较（±s）

采血量/μL n PLT（×109/L） t P 2000（EDTA-K2真空抗凝管） 50 229.65±46.35 100（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 201.45±44.47 -9.437 0.000（＜0.01）150（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 214.37±44.95 -6.224 0.000（＜0.01）200（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 225.00±43.64 -2.003 0.058（＞0.05）300（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 231.47±46.66 -0.922 0.368（＞0.05）400（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 228.00±45.34 -0.903 0.378（＞0.05）500（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 227.95±46.76 -0.732 0.473（＞0.05）600（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 227.05±44.32 -1.525 0.144（＞0.05）700（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 216.23±46.51 -5.586 0.008（＜0.01）800（枸橼酸钠粉剂抗凝管） 50 206.61±47.38 -6.786 0.000（＜0.01）

2.3 枸橼酸钠粉剂抗凝管标本全血细胞计数的结果评价

分别用枸橼酸钠粉剂抗凝管（12.8 mg/管）、枸橼酸钠水剂抗凝管和EDTA-K2真空抗凝管采集110例（30例真性血小板减少患者、50例正常人和30例血小板增多患者）静脉血标本，用仪器法检测枸橼酸钠抗凝标本的白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和PLT结果，用光学法检测EDTA-K2抗凝标本结果，以光学法结果为参考值，结果见表3。结果显示，枸橼酸钠粉剂抗凝标本除WBC结果稍高外（P＜0.05），PLT、RBC、HGB结果均与于EDTA-K2抗凝标本的结果相一致，差异无统计学意义；而枸橼酸钠水剂抗凝标本由于受抗凝剂溶液体积的影响，其全血细胞结果均明显低于参考值，差异有统计学意义。

2.4 EDTA-PTCP患者不同抗凝剂标本PLT计数的结果比较

表3 3种抗凝剂标本全血细胞计数结果的比较（±s）

表3 3种抗凝剂标本全血细胞计数结果的比较（±s）

注：与EDTA-K2标本结果相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与枸橼酸钠粉剂标本结果相比，△P＜0.01

检测项目 WBC（×109/L）RBC（×1012/L）枸橼酸钠粉剂抗凝管8.39±2.19* 4.34±0.41 HGB/（g·L-1）127.33±15.20 PLT（×109/L）251.53±68.35枸橼酸钠水剂抗凝管6.93±1.67**△ 3.96±0.37**△115.47±14.47**△218.53±56.61**△EDTA-K2真空抗凝管7.63±1.96 4.34±0.41126.53±15.20257.02±72.28

用4种抗凝管采集28例EDTA-PTCP患者静脉血，用仪器法检测其PLT数量，以新鲜末梢血标本的手工法结果为参考值，结果见表4。结果显示，枸橼酸钠粉剂抗凝标本的PLT结果最接近手工法的参考值，差异无统计学意义，其抗凝效果优于枸橼酸钠真空抗凝管和肝素抗凝管。

表4 28例EDTA-PTCP患者不同抗凝剂采血标本的PLT计数结果比较（±s）

表4 28例EDTA-PTCP患者不同抗凝剂采血标本的PLT计数结果比较（±s）

标本类型 方法 PLT（×109/L） t P新鲜末梢血标本 手工法 199.14±47.99 EDTA-K2真空抗凝管标本 仪器法 054.07±23.55 -15.001 0.000（＜0.01）肝素锂真空抗凝管标本 仪器法 108.79±29.33 -15.862 0.000（＜0.01）枸橼酸钠水剂抗凝管标本 仪器法 164.86±48.11 -11.163 0.000（＜0.01）枸橼酸钠粉剂抗凝管标本 仪器法 193.89±50.62 0-1.761 0.090（＞0.05）

选择多例住院EDTA-PTCP患者，用仪器法检测4种抗凝标本的PLT结果，以手工法的检测结果作参考，观察各种抗凝标本PLT结果在不同检测时间（24 h内）的变化趋势，结果大致相近。选择其中1例患者（男，63岁），采用手工法检测PLT为232×109/L，结果如图1所示。由图1可知，EDTA-PTCP患者EDTA-K2标本的PLT采血后在短时间内应迅速降低（由即时116×109/L降至10 min时的17×109/L），然后随检测时间的延长（15 min～24 h），PLT计数结果仍维持在极低水平（约9×109/L）；肝素锂抗凝标本PLT结果在24 h内变化不大，基本维持在100×109/L水平上；枸橼酸钠真空抗凝管标本PLT在2 h内结果较稳定（约170×109/L），但低于参考值，2 h后开始下降；枸橼酸钠粉剂抗凝标本在24 h内PLT结果非常稳定，基本维持在220×109/L水平，最接近手工

图1 不同抗凝剂采血标本PLT计数结果随时间变化趋势图

2.5 EDTA-PTCP患者标本在不同检测时间的PLT结果比较法的参考值。

2.6 EDTA-PTCP患者3种方法抗凝5 min、2 h、24 h后血小板聚集情况

对上例EDTA-PTCP患者的3种方法抗凝（EDTA-K2、枸橼酸钠水剂和枸橼酸钠粉剂）标本在抗凝5 min、2 h、24 h后进行瑞氏-吉姆萨染色，用油镜观察血小板分布情况，如图2所示。结果表明，EDTA-K2诱导血小板产生了快速且不可逆转的强聚集，直接导致了患者EDTA-PTCP的发生；枸橼酸钠真空抗凝（水剂）标本在一定时间内（本例为2 h内）有良好的抗凝效果，但随后血小板也产生了较弱的聚集，导致PLT数量的进一步下降；枸橼酸钠粉剂抗凝标本在24 h内PLT均呈单个散在分布，几乎没有观察到聚集现象，显示出很强的抗凝效果。

图2 油镜下3种方法抗凝5 min、2 h、24 h后血小板聚集图（×1 000）

3 讨论

近年来，EDTA依赖性假性血小板减少症（EDTA-PTCP）引起临床误诊误治的报道逐渐增多[4-5]，其解决措施主要有更换非EDTA抗凝剂计数、血小板手工计数（草酸铵法）、血涂片染色计数、采用免疫标记的流式细胞仪计数和血小板聚集体计数[6]等。实验室应用较多的非EDTA抗凝剂是枸橼酸钠水剂，其采血标本由于已稀释不适于细胞计数[7]，虽可纠正EDTA-PTCP，但不能准确计数PLT。用粉剂枸橼酸钠作抗凝剂采血或许能消除其体积对细胞计数的影响，目前国内尚未有相关报道，本研究将就其粉剂抗凝管的制备及抗凝效果作出新的尝试。

枸橼酸钠粉剂抗凝管的制备较为简单，关键在于其最佳抗凝比例的确定。本研究结果显示，自制枸橼酸钠粉剂抗凝管的最佳抗凝含量为12.8 mg/管，最佳采血量为200～600 μL，当用此抗凝比例（1 mg枸橼酸钠抗凝15.6～46.9 μL血）采血进行全细胞计数时，正常人、真性血小板减少患者和血小板增多患者标本的PLT、RBC、HGB均可获得准确的计数结果，仅WBC计数高于光学法结果，差异有统计学意义，而镜检未见血小板聚集对WBC计数造成的干扰，原因有待进一步研究。枸橼酸钠水剂标本由于受抗凝剂溶液体积的影响，其全血细胞结果均明显低于参考值，证实了许洪钧[7]的研究结果。近2 a沙井人民医院血常规的日均检测量700～1 000人，其中PLT＜100×109/L的有 5～15人。根据血细胞分析仪复检规则[8-9]，对PLT减少的所有患者结果进行了复核确认，共检出28例EDTA-PTCP患者，包括6例4个月～1岁的患儿。通过对28例EDTA-PTCP患者PLT的检测发现，其肝素抗凝标本PLT远远低于手工法结果，说明肝素抗凝标本不适用于PLT计数；枸橼酸钠水剂抗凝标本可纠正EDTA-PTCP，但其PLT结果亦明显低于枸橼酸钠粉剂抗凝标本及手工法结果，差异有统计学意义，其原因可能是抗凝比例不同引起：经换算，枸橼酸钠水剂抗凝比例为1 mg枸橼酸钠抗凝312.5 μL血，远远高于枸橼酸钠粉剂的1∶15.6～1∶46.9，其抗凝标本仅适合做凝血功能检测而不适于做PLT计数。本研究在24 h内对EDTA-PTCP患者不同抗凝剂标本PLT结果随检测时间的变化作了持续观察，同时选择抗凝5 min、2 h、24 h后的血涂片染色镜检加以观察血小板分布、聚集情况。结果显示，EDTA-K2标本的PLT在采血后几分钟内就迅速降低，随后长时间内PLT仍维持在极低水平，镜检结果显示EDTA-K2诱导血小板产生了快速且不可逆转的强聚集；枸橼酸钠水剂抗凝标本PLT在2 h内结果较稳定，PLT没有发生聚集，但在2 h后PLT开始下降，镜检发现了小簇状聚集的PLT，与邝妙欢[10]的研究结果一致。进一步的研究表明[11]，离体2 h后血小板表面糖蛋白PAC-1、CD62P、CD63及凝血酶敏感蛋白（TSP）表达量明显增加，血小板活化后导致了其聚集性的增加；枸橼酸钠粉剂抗凝标本在24h内PLT结果非常稳定，与手工法的结果基本一致，涂片血小板均呈单个散在分布，几乎没有观察到聚集现象，显示出很强的抗凝效果。

EDTA-PTCP的发病机制尚未完全阐明，可能与纤维蛋白原受体、糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa）、血小板表面的隐匿性抗原有关[12-13]。周小棉等[14]报道了1例非常罕见的包括EDTA盐、枸盐酸钠、肝素锂、氟化钠等多种抗凝剂所致的血小板假性减少症患者，发现只有高浓度的丁胺卡那霉素才能抑制血小板聚集，足以说明EDTA-PTCP形成原因的复杂性。在纠正EDTA-PTCP的主要方法中，免疫标记的流式细胞仪计数和血小板聚集体计数因需要用到特殊仪器而限制了它们的应用，血涂片染色计数则要求检验人员具备血液学的相关知识，手工计数法作为血小板计数的参考方法，也存在精密度差、准确度低等缺点，一般用于血小板计数的校准。而自制枸橼酸钠粉剂抗凝管具有制备简单、计数准确、所需标本量少等优点，在纠正EDTA-PTCP中效果显著，尤其适用于静脉采血困难婴幼儿EDTA-PTCP的排查。然而，本研究尚属初步研究，列入观察的EDTA-PTCP患者例数不多，且血小板聚集受多种因素（如麻醉、抗血栓药物的使用、手术、血小板功能缺陷等）影响，因而枸橼酸钠粉剂抗凝管纠正EDTA-PTCP的效果或许存在个体差异，但仍不失为一种简单、实用的方法。

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（收稿：2014-03-21 修回：2014-07-20）

Preparation of sodium citrate powder tubes for anticoagulation and evaluation of its clinical application

HUA Jian-jiang,HE Wei-na,DU Ji-kun,LIANG Qiao-ling,XU Zhi-kang,HUANG Jiang-hao,ZHONG Yu
（Department of Clinical Laboratory Medicine,Shenzhen Shajing Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Shenzhen 518104,Guangdong Province,China）

ObjectiveTo prepare sodium citrate powder tubes and evaluate its application in EDTA-dependent pseudothrombocytopenia(EDTA-PTCP).MethodsNa3C6H5O7·2H2O(109 mmol/L)of different volumes were added into different glass tubes and dried to powder at 56℃,respectively.The different tubes were used to deal with the blood samples. Four methods including apparatus method,optical method,manual method,and staining method were used to detect the PLT of 238 specimens,and the differences were compared between the anticoagulation effects with sodium citrate powder tubes,sodium citrate solution tubes and heparin lithium anticoagulant tubes.ResultsThe PLT of anticoagulant specimens (with 12.8 mg sodium citrate powder)for control(n=50)was close to the result of EDTA-K2method,and no significant difference was found between the two methods.The result of PLT was similar with that of EDTA-K2method when the blood volume for the anticoagulant specimens was between 200 and 600 μL.In control group,the PLT,RBC,and HGB of the anticoagulant specimens were similar with those by EDTA-K2method(P＞0.05)except the WBC.In the EDTAPTCP group(n=28),the PLT of sodium citrate powder tubes,sodium citrate solution tubes,and heparin lithium anticoagulant tubes were（193.89±50.62）×109/L,（164.86±48.11）×109/L,and（108.79±29.33）×109/L,respectively,and the result of manual method were(199.14±47.99)×109/L;no significant difference was found between the sodium citrate powder tube method and manual method,while significant difference was found between the sodium citrate solution tubes,heparin lithium anticoagulant tubes and manual method (P＜0.01).The result of PLT for the anticoagulant specimens was stable within 24 hours,and no platelet aggregation was observed.ConclusionThe best anticoagulation content of the self-manufactured sodium citrate powder tube is 12.8 mg per tube,and the best amount of blood sampling is between 200 and 600 μL. The self-manufactured sodium citrate powder tube has the accuracy in correcting EDTA-PTCP better than that of sodium citrate solution tubes and heparin lithium anticoagulant tubes.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（1）：82-86]

sodium citrate;dry powder;EDTA-dependent pseudothrombocytopenia

R318.6；R558.2

A

1003-8868（2015）01-0082-05

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.01.082

深圳市宝安区科技计划资助项目（2013143）

华建江（1973—），男，副主任技师，主要从事血液疾病检验方面的研究工作，E-mail：hjianjiang13@163.com。

518104广东深圳，深圳市宝安区沙井人民医院检验科（华建江，何维娜，杜纪坤，梁巧玲，徐志康，黄江浩，钟 瑜）