miRNA-30a在肾细胞癌中的表达及作用

秦丹丹 任野平

·临床研究与应用·

miRNA-30a在肾细胞癌中的表达及作用

秦丹丹 任野平

目的：探讨微小RNA（miRNA）-30a在肾细胞癌组织和细胞中表达及其临床意义。方法：收集95例2006年4月至2011年3月哈尔滨医科大学附属第二医院收治患者，从获取的新鲜肾细胞癌组织和对应的正常对照组织样本以及肾癌细胞系中分别提取总RNA，应用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法检测miRNA-30a表达水平，并分析miRNA-30a与临床病理资料和预后的关系。采用生物信息学方法预测可能的靶基因并进行验证。利用MTT法验证miRNA-30a对细胞增殖的作用。结果：miRNA-30a在肾癌组织中表达水平显著低于正常肾组织（P＜0.01），在肾癌细胞系中表达低于正常肾上皮细胞。miRNA-30a可抑制肾癌细胞的增殖。生物信息学方法和qRT-PCR表明，异黏蛋白（MTDH）为miRNA-30a靶基因。Kaplan-Meier生存分析显示，miRNA-30a高表达的肾癌患者总生存期优于低表达者（P＜0.01）。结论：miRNA-30a在肾癌中低表达，miRNA-30a低表达与肾癌不良预后有关，并且miRNA-30a可通过MTDH抑制肾癌细胞的增殖。

肾细胞癌 miRNA-30a 增殖 预后 异黏蛋白

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是肾脏常见的一种恶性肿瘤，占全身肿瘤3%，且近20年肾细胞癌的发病率有所升高［1］。肾癌主要治疗方法为手术，但约30%患者术后3年内肿瘤复发，其5年生存率低于10%，另外约25%患者确诊时已经发生转移［2］。因此，寻找一种可靠的生物学标记物，能对肾细胞癌进行早期诊断并能判断患者预后以及指导个体化治疗具有重要的意义。miRNA可通过影响肿瘤的增殖、迁移、侵袭等环节发挥重要的作用。microRNA（miRNA）是一种长度约为22个核苷酸的非编码单链小RNA，主要功能是负性

调节靶基因表达。自1993年以来，迄今为止发现的miRNA已超过1 000种。成熟的miRNA可与相关蛋白结合形成RNA诱导复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC进一步与靶基因的3'-非翻译区（3'-UTR3）结合，对mRNA的稳定性或翻译进行抑制。本研究检测肾癌组织中miRNA-30a表达，分析其与临床病理之间的关系，并初步检测miRNA-30a对肾癌细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2006年4月至2011年3月哈尔滨医科大学附属第二医院收治肾细胞癌患者95例，男性34例，女性61例，中位年龄60（38～84）岁，均接受手术治疗。癌灶中央部位组织和作为对照的对应癌旁正常组织均经病理检查确诊，术前未行放化疗或其他治疗。切除标本后，立即将组织储存于液氮中，存于-80℃，待用。肾透明细胞癌细胞株ACHN、Caki-1、Caki-2、786-0、A498、Ketr-3以及正常人肾脏细胞HK-2均购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。细胞使用含1%链霉素-氨苄青霉素、10%胎牛血清的DMEM，并在37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。RNA提取试剂盒购自美国Thermo公司。反转录试剂盒及实时定量PCR（qRT-PCR）试剂盒均购自德国QIAGEN公司。所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 Caki-1和Caki-2细胞转染 miRNA-30a类似物/类似物对照物（NC）和miRNA-30a抑制剂/抑制剂对照物购自上海吉玛公司。根据Lipofectamine 2000使用说明，对细胞进行瞬时转染，转染后提取细胞RNA核蛋白以行qRT-PCR和Western blot。

1.2.2 RNA提取和qRT-PCR检测 按照试剂使用说明，使用Trizol提取细胞或组织总RNA。使用U6作为miRNA定量的内参。采用SYBR Green PCR Master Mix进行qRT-PCR，对RNA进行定量。β-actin作为mRNA定量的内参。所用引物如下：miRNA-30a上游引物为5'-GCCTGTAAACATCCTCGACTGGAAG-3'，下游引物为5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；异黏蛋白（metadherin，MTDH）上游引物为5'-ATCACAGTTA CCACCGAGCA-3'，下游引物为5'-CTTCTCCTCACC TGCACTGA-3'。miRNA表达水平以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt= ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖能力 对细胞进行miR⁃NA-30a类似物和抑制剂转染，24 h后将细胞消化后行细胞计数。96孔板铺板细胞密度为7.5×103/mL，每组6个复孔，置37℃、5%CO2培养箱培养，连续检测4天。从铺板后第2天开始，加入10 μL/孔MTT（5 g/L），继续培养4 h，弃掉培养液，加入150 μL/孔二甲基亚砜（DMSO）终止反应。检测490 nm处吸光值。

1.2.4 生物信息学方法预测靶基因 使用miRNABase，TargetScan，PicTar和miRNAanda方法预测miRNA-30a可能的靶基因与结合位点。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。采用非参数秩和检验分析组织中miRNA-30a表达差异。采用χ2检验分析miRNA-30a表达水平与临床病理参数之间关系，Kaplan-Meier和Log rank方法分析miRNA-30a表达与患者生存率关系。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-30a在癌组织和肾癌细胞系中表达

qRT-PCR分析结果显示，miRNA-30a在大部分肾癌组织中表达显著降低（图1A），miRNA-30a表达在肾癌细胞系中低于非癌细胞系，两者比较差异具有统计学意义（图1B）。

2.2 miRNA-30a与临床病理指标的关系

为明确miRNA-30a在肾癌中的作用，进行miRNA-30a表达水平与临床病理参数之间的分析。结果显示，miRNA-30a表达水平与患者性别、肿瘤分化水平、肿瘤大小（以肿瘤长径与短径乘积表示大小、选取中位数为界值分组）以及病理类型无明显相关性（P＞0.05），miRNA-30a与肿瘤的分期呈负相关。表明miRNA-30a可能具有抑制肾癌的作用（表1）。

2.3 miRNA-30a表达与患者总生存期的关系

肾癌患者miRNA-30a表达水平以ΔΔCt=0.70为界分为高表达和低表达。Kaplan-Meier生存分析显示，miRNA-30a高表达患者预后明显较好，高、低表达的中位生存期分别为41（12～60）、52（15～60）个月（P=0.006，图2）。

图1 miRNA-30a在癌组织和肾癌细胞系中的表达Figure 1 miRNA-30aexpressioninrenalcancertissuesandcelllines

表1 miRNA-30a与95例患者临床病理的关系Table 1 Correlation between the clinicopathological characteristics and miRNA-30aexpressionin 95patients

2.4 miRNA-30a对肾癌细胞增殖的作用

分别对miRNA-30a低表达的Caki-1细胞、高表达的Caki-2细胞转染miRNA-30a类似物/类似物对照物或miRNA-30a抑制剂/抑制剂对照物24 h后，行miRNA-30a表达定量分析（图3A）。使用MTT法检测miRNA-30a对细胞增殖的作用，结果表明miRNA-30a过表达可抑制细胞的增殖，抑制miRNA-30a后可促进细胞的增殖（图3B，3C）。

2.5 MTDH与miRNA-30a靶向关系

使用生物信息学软件预测miRNA-30a可能的靶基因，对预测的结果进行筛选，得到与肿瘤关系较密切的靶基因，本研究选定MTDH作为研究对象。MTDH与miRNA-30a结合位点具有物种保守性（图4A斜体部分）。在肾癌细胞中转染miRNA-30a类似物后，MTDH表达被抑制，而转染miRNA-30a抑制剂后MTDH表达上调（图4B），MTDH与miRNA-30a具有靶向关系。

图2 miRNA-30a与肾癌患者预后Figure 2 miRNA-30aexpressionandprognosisinrenalcancerpatients

图3 miRNA-30a对肾癌细胞增殖的作用Figure 3 EffectofmiR-30aonrenalcancercellproliferation

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图4 MTDH与miRNA-30a靶向关系Figure 4 Relationship between the MTDH and the miRNA-30a target gene

3 讨论

越来越多的证据表明，miRNA在恶性肿瘤中表达异常，表明miRNA与肿瘤的发生发展密切相关，可以发挥促癌基因或抑癌基因的作用［3］。研究表明，miRNA-30a在乳腺、肝脏、肺脏、消化系统多种肿瘤中都起着重要作用［4-7］。本研究发现，miRNA-30a在肾癌组织和细胞中低表达，肾癌的分期与表达呈负相关，miRNA-30a高表达的肾癌患者的预后优于低表达者。肿瘤的分化程度虽与病理类型以及肿瘤的恶性程度相关，但本研究中miRNA-30a与肿瘤的分化程度和病理类型无明显相关性，这可能与miRNA的组织特异性相关。

肿瘤的发生发展过程中常常发生染色体的失衡，包括染色体扩增、缺失或表观遗传学的变化。miRNA-30a位于染色体6q13，有研究表明在某些癌症中由于杂合性丢失会导致其成为基因组脆性区域［8］。本研究发现，miRNA-30a在肾癌中表达下降，与上述的研究结果一致。

在多种肿瘤中进行了miR-30家族成员研究，虽然miR-30家族5个成员之间序列高度相同，但行使的功能却有差别。有研究表明，在黑色素瘤中miRNA-30b/d可增强肿瘤的侵袭能力，从而发挥癌基因的作用［9］。miR-30e与miR-30b/d的种子序列虽相同，但与之相反的是在乳腺癌中miR-30e可发挥抑制癌细胞转移的作用［10］。Baraniskin等［11］研究表明，miRNA-30a可通过靶向DTL（denticleless protein homolog）抑制结肠癌的增殖。这些研究表明，miRNA功能的行使可能与其靶标有关，而且在不同类型的组织和细胞中，miRNA行使的功能也不同。

MTDH在肿瘤的发生发展过程中起到了重要作用。MTDH基因位于染色体8q22上，在乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和星形胶质细胞瘤等多种肿瘤中高表达并且与不良预后相关［12］。MTDH介导了多种形式的化疗抵抗，有研究表明下调MTDH表达可增加肿瘤细胞对顺铂、多柔比星等药物介导的细胞死亡［13］。MTDH可增强肿瘤细胞的侵袭性，通过NF-κB途径增加相关黏附分子的表达，MTDH是Ha-ras下游基因，Ha-ras通过P13K/AKT/GSK3B/c-Myc途径诱导MTDH大量表达［14］。尚有实验表明，在乳腺癌中miRNA-30a可通过MTDH实现对肿瘤细胞的抑制作用［15］。本研究表明miRNA-30a对肿瘤细胞生物学行为的抑制作用可能是通过靶向MTDH实现的。

总之，本研究结果初步表明miRNA-30a可抑制肾癌的增殖，并且可改善肾癌患者的预后，应在转移和侵袭方面继续探讨miRNA-30a的作用。另外，基于miRNA家族成员之间发挥功能不同的特点，有必要研究miRNA家族所有成员在肾癌中的作用。在不久的将来miRNA-30a可能作为潜在的治疗靶点。

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（2015-02-05收稿）

（2015-06-23修回）

秦丹丹 专业方向为狼疮肾，肾肿瘤的临床及基础研究。

E-mail：qindandan1989@126.com

IARC发布乳腺癌筛查指南

2014年11月，世界卫生组织国际癌症研究署（WHO/IARC）在法国里昂召集了16个国家的25位专家，对现有的乳腺癌筛查技术与方案的优劣进行评估，重新制定乳腺癌筛查手册，为世界各国开展乳腺癌筛查提供指导性意见，所形成的共识于6月3日在线发表于《新英格兰医学杂志》（N Engl J Med）。中国医学科学院肿瘤医院乔友林教授、《中国肿瘤临床》编委是唯一参加该筛查手册制定的中国专家。

指导意见进一步肯定了钼靶作为乳腺癌筛查方法的有效性，大量数据表明钼靶筛查可明显降低50～69岁女性死亡率，对于70～74岁女性的死亡率也有显著降低，但是对于40～49岁女性，现存证据有限。该报告同时指出筛查带来的风险如过度诊断、短期负面心理影响和检查所产生的射线对乳腺癌发病率的影响，但考虑到筛查收益显著大于射线产生的危害，IARC强烈建议对50～69岁女性开展有组织的定期钼靶筛查，但现有证据仍无法确定最佳筛查间隔。

其他影像学方法及乳腺临床检查和自检的评估指导意见指出，超声作为钼靶的辅助筛查技术在致密性乳房的女性中可提高钼靶阴性结果中的乳腺癌检出率，但也增加假阳性概率。值得注意的是，目前基于超声的研究全部来自于观察性研究，尚无高质量、设计严谨的前瞻性临床随机对照试验，无法评估其是否可降低人群乳腺癌死亡率。与超声相似，临床手诊也缺少前瞻性临床随机对照试验，难以评估其对死亡率的影响。现有证据仅表明，相比未筛查组，临床手诊组检出的乳腺癌病灶更小，肿瘤分期更早。对于其他影像学检测技术，现有数据仅发现断层成像技术辅助钼靶筛查可显著提高原位癌和浸润性乳腺癌检出率，但对人群死亡率的影响证据尚不充分。高危人群中多种筛查技术联合方案，如核磁共振辅助钼靶/超声等有效性尚待研究证实。

——引自“医学论坛网”网站

miRNA-30a expression in renal cell carcinoma and its effect on renal cancer cells

Dandan QIN,Yeping REN
Department of Nephrology,The 2ndAffiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China.

Yeping REN;E-mail:renyeping0123@126.com

Objective:To investigate the expression and clinical significance of microRNA-30a in renal cell carcinoma(RCC). Methods:The miRNA-30a expression in renal tissues and cell lines was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR),and the relationship between miRNA-30a expression and the clinicopathological features of RCC was analyzed.The effect of miRNA-30a on cancer cells was evaluated using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay.In addition,a bioinformatics algorithm was adopted to predict the potential targets of miRNA-30a.Results:miRNA-30a was downregulated both in RCC tissues and cell lines.Patients with higher miRNA-30a expression exhibited better prognosis than those with lower miRNA-30a expression.Bioinformatics algorithm and qRT-PCR both indicated that metadherin(MTDH)was a target of miRNA-30a.Moreover,MTT results showed that miRNA-30a could inhibit cell proliferation.Conclusion:miRNA-30a was inhibited in renal cancer,and low miRNA-30a expression was associated with poor prognosis.In addition,miRNA-30a could inhibit the growth of cells through MTDH.

renal cell cancer,miRNA-30a,proliferation,prognosis,MTDH

10.3969/j.issn.1000-8179.20150182

哈尔滨医科大学附属第二医院肾内一科（哈尔滨市150086）

任野平 renyeping0123@126.com