枸杞根腐病病原菌的生物学特性研究

朱晓峰，刘宏军，席军强，孟文生，裴艳红

（1.甘肃省张掖市林木种苗管理站，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省平凉市关山林业管理局，甘肃 平凉 744100）

枸杞根腐病病原菌的生物学特性研究

朱晓峰1，刘宏军1，席军强2，孟文生1，裴艳红1

（1.甘肃省张掖市林木种苗管理站，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省平凉市关山林业管理局，甘肃 平凉 744100）

为给枸杞根腐病的有效防治提供科学依据，以甘肃省内枸杞主产区枸杞根腐病病株中分离鉴定的单隔镰孢菌为研究对象，对其在不同培养基、温度、光照、pH值、碳源和氮源上的生长状态与特性进行了观测与分析。结果表明：适于单隔镰孢菌生长的最适培养基为豆芽汁培养基；最适宜的温度范围为15～35 ℃，最适温度为35 ℃；适宜的pH值范围为4～10，最适的pH值为9；供试的4种碳源均能被其利用，其中以乳糖的利用效果为最好；该菌株能够利用供试的4种氮源，其对硫酸铵的利用效果最差；光暗交替的培养环境有利于菌丝生长，而连续黑暗的培养环境却能抑制菌丝生长。

枸杞；根腐病；病原菌；生物学特性

枸杞Lycium bararumL.为茄科多年生落叶灌木，是重要的药食两用经济植物资源，具有耐盐碱、耐寒、抗旱、抗热、适应性强等特性，也是治理荒漠化土地的生态树种[1-2]。近几年，随着枸杞种植效益的提高，甘肃省白银市枸杞种植规模不断扩大，并集中形成了靖远县靖安、五合、东升和北滩及景泰县草窝滩多处枸杞优势产区，枸杞多种病害的发生也逐年加重，防控难度进一步加大[3]。枸杞根腐病是一种系统感染病害，病株的根和根颈部腐烂，茎秆维管束变褐色。枸杞根腐病病原菌为4种镰孢菌，即尖孢镰孢菌F.oxysporum、茄病镰孢菌F.solani、同色镰孢菌F.concolor和串珠镰孢菌F. moniliforme，其中致病力最强的是尖孢镰孢菌，其次为茄病镰孢菌，同色镰孢菌和串珠镰孢菌均为弱致病菌[4-5]。为给当地枸杞病害的有效防控提供科学依据，从甘肃省枸杞主产区采集枸杞根腐病病株，从中分离鉴定出致病菌单隔镰孢菌，观察其菌丝在不同培养基、碳源、氮源和温度、光照等条件环境下的生长情况，以探求能有效抑制其菌丝生长的栽培条件，从而有效防治枸杞根腐病的发生。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试菌株样品来源：供试的单隔镰孢菌（F.dimerum，代号为M4）由“甘肃省内主要产区枸杞根腐病病原菌分离与鉴定”SRTP项目小组提供。

试验用的药品：胰蛋白胨、磷酸氢二钾、葡萄糖、琼脂、结晶硫酸亚铁、结晶硫酸镁、氯化钾、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘油、硝酸钾、硝酸钠、甘氨酸、硫酸铵。

试验用的仪器设备：SW-CJ-2FD型洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-30KB8型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DHP-9272型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；DHG-9440A型电热恒温鼓风干燥箱，宁波江南仪器厂；BS224S型分析电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；金怡HH-S6数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂。

1.2 培养基

供试培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）[6]、马铃薯蔗 糖琼 脂 培 养 基 （Potato Sucrose Agar，PSA）[5]、麦芽汁琼脂培养基（Malt-extract Agar Medium，MEA）[7-8]、豆芽汁琼脂培养基（Bean-sprouts Agar Medium，BSA）[9]、胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖培养基（Tryptone Yeast Extract Glucose，TYEG）[10]和基本培养基（Minimal Medium，MM）[5,8,11]。

供试碳源有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘油；供试氮源包括硝酸钾、硝酸钠、甘氨酸、硫酸铵。

1.3 方 法

1.3.1 单隔镰孢菌最适培养基的筛选

用内径为5mm的灭菌打孔器从在PDA培养基上28 ℃下活化培养的M4菌株的菌落中切取边缘菌饼，将菌饼分别转接到PDA、PSA、BSA、MEA、TYEG培养基中，在25 ℃的恒温条件下连续光照培养7 d，每处理设3次重复。

采用“十”字交叉法分别于培养第3、5、7天记录各处理的菌落直径，以所测数值减去5mm后即可得到该菌株的净生长量。

1.3.2 光照对菌株生长的影响

按照1.3.1的方法将M4菌株转接至PDA培养基中央后，分别置于全光照、全暗和12 h光暗交替的培养环境下，于25 ℃的恒温条件下培养7 d，每处理设3次重复。

采用“十”字交叉法于培养第7天记录各处理的菌落直径，以所测数值减去5mm后即可得到该菌株的净生长量。

1.3.3 温度对菌株生长的影响

按照1.3.1的方法将M4菌株转接至PDA培养基中央后，分别置于5、15、25、35、45 ℃的恒温条件下连续黑暗培养7 d，每处理设3次重复。

采用“十”字交叉法于培养第7天记录各处理的菌落直径，以所测数值减去5mm后即可得到得到该菌株的净生长量。

1.3.4 pH值对菌株生长的影响

用1 mol·L－1的NaOH标准液和1 mol·L－1的HCl标准液将PDA培养基的pH值分别调至3、4、5、6、7、8、9、10，再按照1.3.1的方法将M4菌株分别转接到已调好pH值的PDA培养基中，置于25 ℃的恒温条件下连续光照培养7 d，每处理设3次重复。

采用“十”字交叉法于培养第7天分别记录各处理的菌落直径，以所测数值减去5mm后即可得到该菌株的净生长量。

1.3.5 单隔镰孢菌对碳源的利用

在1 000 mL的基本培养基中加入硝酸钾（0.277 g·L－1），以之为氮源，并将之分装至锥形瓶中，用121 ℃的LDZX-30KB8型立式压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌30 min，将供试的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘油这4种氮源均按20 g·L－1的浓度进行配置，待培养基冷却至50 ℃左右时再加入灭菌的不同碳源，以无碳源培养基处理作为对照（CK1），按照1.3.1的方法将M4菌株分别转接到含有不同碳源的培养基中，置于25℃的恒温条件下连续光照培养7 d，每处理设3次重复。

采用“十”字交叉法分别于培养第3、5、7天记录各处理的菌落直径，测量数字减去5mm后得到该菌株的净生长量。

1.3.6 单隔镰孢菌对氮源的利用

在1 000 mL的基本培养基中加入葡萄糖（20 g·L－1），以之为碳源，并将之分装至锥形瓶中，用121 ℃的LDZX-30KB8型立式压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌30 min，将供试的硝酸钾、硝酸钠、甘氨酸、硫酸铵这4种氮源均按0.277 g·L－1的浓度进行配置，待培养基冷却至50 ℃左右时，加入灭菌的不同氮源，设置无氮源培养基为对照（CK2），按1.3.1的方法将M4菌株分别转接到含有不同氮源的培养基中，置于25 ℃的恒温条件下培养7 d，每处理设3次重复。

采用“十”字交叉法分别于培养第3、5、7天记录各处理的菌落直径，测量数字减去5mm后得到该菌株的净生长量。

1.4 数据处理

采用Mirsoft of fi ce 2007和SPSS 17.0软件进行数据统计与分析，利用单因素方差分析法（oneway ANOVA）进行方差分析，显著性检验采用DPS软件的Duncan法，所有数值均为平均值±标准误差。

2 结果与分析

2.1 培养基对菌落生长的影响

不同培养基对菌株生长的影响情况见表1。单隔镰孢菌在几种供试的培养基中均可生长，但其生长状况及生长速率却有所不同。菌株在豆芽汁培养基上生长最快且其菌丝生长最好，其次是PDA培养基，其余3种培养基上的菌丝生长状况大致相同。因此，豆芽汁培养基为单隔镰孢菌生长的最佳培养基。

表1 M4菌株在不同培养基上的生长状况与生长量†Table 1 Growth status and increments of the M4 strain in different media

2.2 光照条件对菌落生长的影响

不同光照条件下M4菌株生长量的多重比较结果见表2。由表2可知，不同光照条件下M4菌株其菌丝生长量间差异极显著。连续光照和12 h光暗交替的光照条件对菌丝生长的影响均较小，这两种处理的菌丝生长量间无显著性差异，但其菌落形态有所不同；而连续黑暗对菌丝生长的影响却较大。

表2 不同光照条件下M4菌株生长量的多重比较结果Table 2 Multiple comparison of increments of the M4 strain under different light conditions

2.3 培养温度对菌落生长的影响

不同培养温度对菌落生长的影响情况如表3所示。表3表明，不同温度条件对菌丝生长量的影响有显著性差异。M4菌株在15～35 ℃的温度范围内其菌丝均可生长，且在35 ℃时的生长量最大。当培养温度分别为5和45 ℃时，其菌丝生长受到严重抑制，且测不出其生长量。当培养温度为15 ℃时，其菌落呈圆形，气生菌丝呈白色，背面中心呈棕绿色，边缘呈黄色；当培养温度为25 ℃时，其菌落呈圆形，气生菌丝呈白色，背面中央呈灰绿色，边缘呈米黄色；当培养温度为35 ℃时，其菌落呈白色，背面呈黄色。

2.4 培养基的pH值对菌落生长的影响

培养基的pH值对菌落生长的影响情况亦如表3所示。由表3可知，单隔镰孢菌在pH值为4～10的PDA培养基中均可生长。当PDA培养基的pH值分别为5、6、7、8、10时，其对菌丝生长的影响均不显著，pH值分别为4与9的PDA培养基对菌丝生长的影响显著；当PDA培养基的pH值为9时，菌丝生长量最大，培养第7天的菌丝生长量为6.07cm；当PDA培养基的pH值为4时，菌丝生长量最小，培养第7天的菌丝生长量为4.52cm。当其pH值为4时，菌落中央呈玫红色，背面呈砖红色；当其pH值分别为5、6、7、8、9时，菌落中央呈灰棕色，且随着pH值的升高其颜色变浅，范围变小，背面呈黄色；随着pH值的降低，菌落中央出现绿色和红色。

表3 不同温度与pH值影响下M4菌株的菌丝生长量Table 3 Mycelium increments of the M4 strain under different temperatures and pH values

2.5 单隔镰孢菌对碳源的利用

不同碳源与氮源条件下M4菌株的菌丝生长量见表4。由表4 可知，单隔镰孢菌能够利用供试的4种碳源，这4种碳源对其生长量的影响，除以葡萄糖、甘油和麦芽糖为碳源的各处理与对照间的差异均不显著外，其余各种碳源处理间均有显著差异，其中，以乳糖为碳源的生长最佳，葡萄糖的次之。

2.6 单隔镰孢菌对氮源的利用

不同氮源条件下M4菌株的菌丝生长量亦见表4。由表4 可知，单隔镰孢菌能够利用供试的4种氮源，其中甘氨酸、硝酸钾、硝酸钠对菌丝生长的影响差异均不显著。以甘氨酸、硝酸钾、硝酸钠为氮源时，菌落生长形态正常；以硫酸铵为氮源时，菌落生长缓慢，且培养5天后其生长停滞；无碳源处理（对照）的菌落形态尚未形成，其菌丝极其稀疏，且不易观察到。

表4 不同碳源与氮源条件下M4菌株的菌丝生长量Table 4 Mycelium increments of the M4 strain under different carbon sources and nitrogen sources

3 结论与讨论

试验中发现，单隔镰孢菌在PDA、PSA、BSA、MSA、TYEG培养基上均能生长，其中BSA培养基更适合单隔镰孢菌的生长，而其在PSA培养基上的生长速度最慢。单隔镰孢菌能利用供试碳源乳糖、葡萄糖、甘油、麦芽糖和供试氮源甘氨酸、硝酸钾、硝酸钠、硫酸铵，但不同碳源和氮源对单隔镰孢菌菌落生长的影响均较大。单隔镰孢菌能够利用甘氨酸、硝酸钾、硝酸钠这3种氮源进行生长，且能很好地利用乳糖碳源进行生长，其菌落生长较快，形态正常；其对硫酸铵的利用效果差，菌落生长较慢，其形态不规则，且培养第5天后其生长停滞。在无碳源条件下，菌落能够正常生长，而在无氮源条件下，只有极其稀疏的菌丝生长，菌落形态不明显，表明单隔镰刀菌的营养生长主要依赖于氮源。

研究中还发现，单隔镰孢菌菌丝在连续光照、连续黑暗和12 h光暗交替的环境下均能生长，而连续黑暗能抑制菌丝生长。单隔镰孢菌在温度为15～35 ℃的范围内均可生长，且菌落茂密；但在5、45 ℃的温度条件下其生长停滞，其生长适温为15～35 ℃，说明该菌株适宜相对中温偏高的环境。单隔镰孢菌菌株能在pH值为4～10的培养基上生长，最适于单隔镰孢菌生长的pH值为9，说明该菌株适于偏碱性条件下生长。

可见，单隔镰孢菌对环境的适应能力强，这一特性使得它们能够在枸杞种植区内生存。甘肃枸杞主要产区的气候和环境正好为它们提供了良好的生存条件，况且枸杞又是多年生的植物，土壤带菌量会逐年积累，这是造成枸杞根腐病逐年加重的原因之一。

枸杞根腐病防治的主要目标是抑制单隔镰孢菌的生长。在生产实际中主要以健康栽培和生物防治、物理防治、农业防治为主，以化学防治为辅，还可通过改变栽培技术来减轻此病危害的程度，最大限度地减少农药的使用量，尽可能实现无公害化栽培。同时，通过合理施肥，既可提高枸杞林木生长量和产品产量，还能提高产品的品质[12-14]。另外，通过控制单隔镰孢菌生长发育的适宜条件来抑制根腐病病原菌的生长，进而减轻枸杞病害的危害程度。

试验结果表明，单隔镰孢菌在连续黑暗、强碱性、超低温或高温环境下其生长受到抑制。因此，枸杞应栽植于强碱性土壤，在开花结果时可采用遮阳网遮阴、灌水等防治措施，以营造暗环境，降低土温，抑制病原菌的滋生。同时，对于发病区，可采用轮作方式，栽植时要平整土地，起垄栽培，以降低地下水位，减少根际积水，防止碱性离子堆积于枸杞根部；除草、翻耕土地时应尽可能避免伤根；采用配方施肥技术，增施磷肥、钾肥，避免施用未经腐熟的农家肥。近年来，随着分子生物学的快速发展，本试验运用传统的试验方法进行研究，可能存在很多方面的不足，因此，今后对此病原菌的致病机理等方面的问题，应采用分子生物学的方法作进一步的试验研究。

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Biological characteristics of root rot pathogen inLycium barbarum

ZHU Xiao-feng1, LIU Hong-jun1, XI Jun-qiang2, MENG Wen-sheng1, PEI Yan-hong1
(1. Management Station of Forest Tree Seedlings of Zhangye City, Zhangye 734000, Gansu, China;2. Guanshan Forestry Authority of Pingling City, Pingliang 744100, Gansu, China )

In order to provide a scienti fi c basis for control of root rot pathogen inLycium barbarum, growth state and characteristics ofFusarium dimerumwere observed and analyzed under the conditions of different medium, temperature,pH value, carbon source and nitrogen source, which was isolated from rotted root inL. barbarumat main production areas of Gansu. The results showed that： the best medium forF. dimerumgrowth was the bean-sprouts-extract medium;the most suitable temperature range was 15-35 ℃ , and the optimum growth temperature was 35 ℃ ; suitable pH value range was from 4 to 10, and the optimal pH value was 9; four carbon sources could be used, and utilization effect of lactose was the best; four nitrogen sources could be used, and utilization effect of ammonium sulfate was the best;alternation of light and darkness was conducive to mycelium growth, and continuous dark culture condition could inhibit mycelium growth.

Lycium bararum; root rot; pathogenic bacteria; biological characteristics

S664.9；S763.15

A

1003—8981(2015)04—0128—05

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.04.024

2014-10-19

甘肃省林果产业科技创新项目（2012）。

朱晓峰，助理工程师。

刘宏军，林业工程师。E-mail：zylmzm@126.com

朱晓峰,刘宏军,席军强,等.枸杞根腐病病原菌的生物学特性研究[J].经济林研究,2015,33(4)：128－132.

[本文编校：伍敏涛]