乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床应用

贾红龙

乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床应用

贾红龙①

目的：探讨乙型肝炎患者HBV-DNA含量与其乙型肝炎血清学标志物的关系。方法：采用微板核酸杂交技术对200例乙型肝炎血清学标志物阳性的患者和20例正常健康人群，进行HBV-DNA PCR定量检测。结果：根据血清学标志物分为五组，HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性患者HBV-DNA含量高于其他患者，比较差异有统计学意义（P＜0.05），HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性患者与HBsAg、抗-HBc均阳性患者DNA拷贝数比较差异无统计学意义。结论：乙肝血清学标志物作为乙肝病毒有无感染的指标不能完全反映患者体内HBV的复制情况，HBV-DNA定量检测对监测乙肝病毒感染的病情发展及抗HBV复制药物的治疗具有重要意义。

乙型肝炎病毒； 微板核酸杂交； 血清学标志物

我国是世界上乙型肝炎病毒感染的高发地区，全国约有50％～70％的人感染过乙型肝炎病毒，约10％的人为携带者。目前我国对乙型肝炎病毒感染的诊断主要依赖于血清特异抗原/抗体的检测。聚合酶链反应（PCR）因其特有的高特异性、高灵敏度在临床检测中得到广泛的应用。笔者采用微板核酸杂交法检测乙肝患者血清HBV-DNA含量，以探讨乙肝患者病毒复制与乙肝病毒标志物之间的关系及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验组为2010年1-12月来本院就诊的患者，共200例，全部病例均为HBV血清学标志物阳性患者，年龄25～75岁，其中男148例，女52例。对照组选择20例体格检查后HBV血清学标志物全阴性、肝功能正常者，其中男10例，女10例。血清采用经高压灭菌的0.5 mL Eppendorf管分装于4 ℃保存，3 d内检测完毕。

1.2 试剂及仪器 试剂：HBV微板核酸杂交定量检测试剂盒（上海浩源生物科技有限公司提供），HBV血清学标志物检测试剂盒（上海科华公司提供）。仪器：PCR扩增仪（英国TECHNE-GENIUS PCR扩增仪），酶标仪（奥地利产SLT-SPECTRA型酶标仪）。

1.3 方法

1.3.1 反应原理 通过裂解液裂解释放DNA，去除杂蛋白，合成两段与目的序列的两端分别互补并标有生物素标记的寡核苷酸引物，在此反应中，生物素标记的引物结合上靶序列，在DNA聚合酶催化下，利用反应体系中的游离核苷酸（dDNA），从5’→3’方向延伸DNA链。产生与靶序列互补的链称为扩增产物。在微孔板中事先包被通用捕集探针，再与接头液分子（一头与板上通用探针互补，另一头与扩增产物互补的特异结合的捕获探针）结合，接头分子捕获扩增产物后，扩增产物上标记的生物素能与亲和素-辣根过氧化物酶结合，通过TMB显色，酶标仪读数。

1.3.2 检测方法 试剂准备：分装PCR主反应液、裂解液、稀释液。标本制备：加入50 μL标本到裂解液（50 μL）中，于37 ℃保温箱保温1 h，加入100 μL中和液，用样品稀释液A稀释，使成为样品原液。再用样品稀释液B稀释样品原液，取稀释后的样品15 μL加入到盛有主反应液的反应管中。加入50 μL石蜡油.

1.3.3 标本检测 将处理后的标本进行扩增、杂交，杂交后用TMB系统进行显色，酶标仪读取读数，定量计算。计算公式拷贝/mL

A：吸光度值（λ=450 nm）；S：阴性对照值；B：PCR前血样稀释倍数；T：PCR后产物稀释倍数。

1.4 统计学处理 根据血清学标志物分组，对各组间DNA拷贝数的比较，所有统计数据使用SAS 6.12统计分析软件，采用单因素方差分析，计量数据采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性患者HBV-DNA含量高于其他患者，比较差异有统计学意义（P＜0.001）；HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性患者与HBsAg、抗-HBc均阳性患者DNA拷贝数比较差异无统计学意义。见表1。

表1 200例乙肝患者血清HBV-DNA含量与其血清标志物的关系

3 讨论

定量测定血清中的HBV-DNA可用于监测乙肝病毒复制状况，从早期的斑点杂交法、bDNA、到竞争性PCR、PCR-ELISA，至现在的微板核酸杂交定量法等，均为了能准确对患者血清中HBV-DNA进行定量和研究，本文通过微板核酸杂交技术对HBV-DNA定量研究其与不同血清学标志物的关系及意义[1-4]。

3.1 HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性 本组为乙肝病毒感染期的标志，该组HBV-DNA检出率高达98.5％，且DNA拷贝数为3.3×107拷贝/mL，说明该组患者乙肝病毒复制最为活跃，提示该类型患者传染性强。这与临床上观察到该类型患者的病情如肝功能反复损害等变化是一致的[5-6]。实验中发现有2例服用拉米夫定的患者，其治疗过程中病毒复制已被抑制，DNA拷贝阴性，但在短暂的时间内血清标志物的转换还未完成。

3.2 HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性 本组为长期乙肝病毒携带标志，其HBV-DNA拷贝数为7.9×105拷贝/mL，说明病毒复制仍较为活跃。经统计学处理，其DNA拷贝数与HBsAg、HBeAg、抗-HBc患者差异有显著统计学意义（P＜0.001）。本组HBeAg转阴，抗-HBe出现，说明人体对乙肝病毒产生免疫应答，但e抗体出现并不能说明病毒复制停止，而只是复制水平降低而已[7]。有文献报道，当HBeAg转阴而抗-HBe作为免疫应答出现时，由于存在着乙肝病毒前C区变异，因而HBV-DNA检测仍保持较高的检出率[8-9]。这在本文的资料中得以证实。

3.3 HBsAg、抗-HBc阳性 结果显示HBsAg与抗-HBc均阳性的患者血清HBV-DNA含量7.2×105拷贝/mL，明显低于HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性患者，说明复制水平较低，传染性较后者弱。本次研究发现虽然本组乙肝病毒e抗原/抗体系统全部转阴，但其DNA拷贝数与HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性患者差异无统计学意义，目前认为是处于HBV感染恢复期或HBV基因突变[10-11]，由于本组资料较少，有待进一步研究。

1999年Makoto[12]报道一些患者和健康携带者出现抗-HBe的同时可检测到持续高滴度的与前C区/C区突变相关的HBV复制。同年Klaw等[13]报道发现一位62岁女患者乙肝表面抗原的新的缺失突变。这些均显示出乙肝五项检测与HBV-DNA定性已无法满足患者或病毒的多型性，而PCR定量方法则能检测HBV病毒自身[14]，更准确灵敏地反应了HBV的感染和治疗恢复情况[15-16]。研究表明，血清中HBV的数量与干扰素的疗效有一定相关性。治疗前HBV-DNA＜100 pg/mL者中50％有效，而＞200 pg/mL者中只有7％有效[17]。近年来，临床上出现了拉米夫定等抗病毒药物，目前关于该药的临床疗效与抗病毒作用，国内外普遍采用PCR定量技术对其进行监测。

乙肝血清学标志物作为乙肝病毒有无感染的一般性检测不能完全反映患者体内HBV的复制情况，HBVDNA定量检测对监测乙肝病毒感染的病情发展及抗HBV复制药物的治疗具有重要意义。可以预见，随着分子诊断概念和技术的发展与推广，HBV-DNA定量在乙肝的治疗方案选择和疗效考察方面必将有广泛的应用前景。

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Quantitative Detection of Hepatitis B Virus and Clinical Application/

J IA Hong-long.//Medical Innovation of China，2015，12（11）：110-112

Objective：To investigate the relation between the amount of HBV-DNA in serum of patients with HBV infection and the marker of hepatitis B virus.Method：Serum HBV-DNA was quantitatively detected by tiny plank nucleic acid hybridize technique of PCR to 200 policlinic patients infected with HBV and 20 healthy men.Result：The men were divided into 5 groups with the marker of HBV， there were significance differences from student test between HBsAg， HBeAg， HBcAb masculine and others.Conclusion：It is as index that the marker of HBV monitor hepatitis Bvirus infection， which couldn’t reflect completely replication of HBV.Quantitative detection of HBV-DNA had important significance to moniter the state of HBV infection and drug treatment.

Hepatitis B virus； Tiny plank nucleic acid hybridize； Marker of serum hepatitis B virus

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.11.038

2014-11-28） （本文编辑：王宇）

①沈阳急救中心 辽宁 沈阳 110006

贾红龙

First-author’s address：Shenyang Emergency Center， Shenyang 110006， China