基于颜色特征的含黄曲霉毒素玉米颗粒的检出方法

褚 璇 王 伟 Lawrence Kurt C Ni Xinzhi Heitschmidt Gerald W 张楠楠 彭彦昆

（中国农业大学工学院1，北京 100083）（美国农业部农业研究所质量与安全评估研究中心2，雅典 30605，美国）（美国农业部农业研究所作物遗传和育种研究中心3，提夫顿 31793，美国）（山东理工大学电气与电子工程学院4，淄博 255049）

基于颜色特征的含黄曲霉毒素玉米颗粒的检出方法

褚 璇1王 伟1Lawrence Kurt C2Ni Xinzhi3Heitschmidt Gerald W2张楠楠4彭彦昆1

（中国农业大学工学院1，北京 100083）（美国农业部农业研究所质量与安全评估研究中心2，雅典 30605，美国）（美国农业部农业研究所作物遗传和育种研究中心3，提夫顿 31793，美国）（山东理工大学电气与电子工程学院4，淄博 255049）

为快速准确识别出感染黄曲霉毒素的玉米颗粒，基于黄曲霉毒素在365 nm紫外光照射下可发出黄绿色荧光（bright greenish－yellow fluorescence，BGYF）的特性，提出了一种以颜色为特征量的感染毒素颗粒的检出方法。首先针对同一组玉米颗粒样本分别获取其在紫外光和可见光下的2幅图像，对可见光图像进行二值化、颗粒区域填充等预处理操作，得到玉米颗粒的轮廓与位置信息；然后将进行彩色增强后的紫外光图像与预处理后的可见光图像掩膜；最后在掩膜图像中通过RGB模型中G通道下的阈值作为分割参数识别玉米颗粒上的感染区域。结果表明，所提出的识别方法对能够发出荧光的含黄曲霉菌玉米颗粒识别准确率达到84%以上，对含有黄曲霉毒素的正确检出率可达77.8%以上，能够达到区分检测的要求。

玉米 黄曲霉毒素 彩色荧光图像 黄绿色荧光 无损检测

玉米是我国主要的经济型粮食作物，但在高温干旱环境下极易受到黄曲霉毒素的污染［1－2］。据FAO统计，全球每年25%的粮食产品因真菌毒素污染而不能食用［3］。黄曲霉毒素属于真菌毒素，是某些黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的毒性代谢产物，能够致癌、致畸、致突变［4－5］，其毒性也可通过食物链累积，更加大了危害人体健康的可能性。据调查，近年来肝癌的发病人群持续增加与食用因霉变而感染黄曲霉毒素的粮食密切相关［6］。因此，检测出受到黄曲霉毒素污染的玉米，对保证人民生命财产安全和我国粮食来源的可持续性安全都具有十分重要的现实意义。

黄曲霉毒素的传统检测方法有气相色谱法（GC）［7］、高效液相色谱法（HPLC）［8］、薄层色谱法（TLC）、酶联免疫（ELISA）［9］等，这些方法操作复杂、采样准备时间长、费用高，不适合在线批量检测［10］。另外，虽也有通过电子鼻或人工嗅觉实现粮食霉变的快速检测［11－12］，但这些方法的检测对象是封存在仓储室中的粮食，无法满足在线检测的需要。

相比之下，机器视觉技术能够静态或实时获得图像信息，并通过相应算法获取检测目标，具有快速、准确和无损等优点，正越来越多地代替人工完成工作［13］，机器视觉技术在农作物种子质量检验中的应用研究进展迅速［14－17］。Pearson等［18］利用机器视觉技术区分开心果中的污渍果仁、干瘪果仁和霉变果仁。在霉变粮食检测方面，Liu等［19］通过机器视觉系统计算精大米表面的类脂物，进而实现大米分级。陈红等［20］以颜色和纹理特征作为输入，较好地识别出霉变的花生。

国外研究结果表明［21－23］，当玉米颗粒感染黄曲霉菌时，在365 nm紫外光下会激发出黄绿色荧光（bright greenish－yellow fluorescence，BGYF），这是含有过氧化酶的活细胞的一种特性。由于黄曲霉菌在玉米颗粒中生长时会产生曲酸并将其转化成过氧物酶形式的BGYF化合物，同时，在这个过程中也会产生黄曲霉毒素。鉴于黄曲霉毒素与产生黄绿色荧光的化合物有大部分重叠，可以通过获取待检玉米颗粒在紫外光下的图像，以图像中颗粒上是否含有荧光部分作为依据，判断其是否含有黄曲霉毒素。

但紫外光下的所获得的图像，对玉米颗粒轮廓和样品背景等特征信息辨识度有限，而利用可见光下的图像则可以很容易的对轮廓信息进行准确识别。因此本试验同时获取玉米颗粒在365 nm紫外光和可见光下的2幅图像，同步获得荧光信息和完整玉米颗粒轮廓等图像信息，基于VS2010软件平台编程，通过2张图像配合，实现对感染黄曲霉毒素玉米颗粒的识别。

1 材料与方法

1.1 样品准备

选用2012年8月在美国乔治亚州，提夫顿市（Tifton，Georgia，USA）收获的玉米颗粒为样本进行图像采集。为保证样本在收获时已感染黄曲霉菌，在这些玉米生长早期，便通过钢针向玉米穗注入了3 mL浓度为4×106孢子／mL的黄曲霉菌分生孢子悬浮液。收获后，首先用空气干燥机对玉米棒进行干燥，然后在通风橱内剥去外皮，并用365 nm波长的紫外光照射，用镊子提取表现出荧光的颗粒及其周围的颗粒，另外提取距离发荧光颗粒较远的不发荧光的颗粒作为对照。将提取出的玉米颗粒按顺序摆放在用白色Teflon制作的背景板上，每个背景板上有30个容孔，其中因感染严重而破损的颗粒放置在最右侧的3列，正常玉米颗粒则放置在最左侧的两列，并保证每粒的玉米的胚芽和尖端朝向一致。

1.2 图像获取与化学检测

为保证足够的清晰度，试验采用分辨率为4 256×2 832的相机。首先在LED光源下获得玉米颗粒的可见光图像（图1a）所示，然后在保证相机与样品相对位置不变，仅有光源更换的前提下，获取365 nm紫外光下的图像（图1b）。

图1 在LED和紫外光下相机获得的图像

1.3 样品化学检测

样品进行图像采集后，用液相色谱法逐粒检测其黄曲霉毒素的含量。首先，将每个颗粒单独粉碎并称重，从中取0.1～0.105 g进行检测，如果1个颗粒的粉末重量没有达到0.1 g，则用整个玉米的粉末；然后，将样品通过4∶1甲醇水溶液进行萃取，在0.1 g粉末中加入2 mL溶液，并在振荡器上振荡30 min，最后，取1 mL提取液用蒸馏水稀释4倍后将其缓慢通过AflaTest免疫亲和柱，在用蒸馏水清洗2次后用甲醇洗脱，并保存洗脱液进行高效液相色谱检测。

1.4 试验总体思路

使用高分辨率相机分别获得玉米颗粒在紫外光下和可见光下的图像，首先为克服紫外光下图像玉米颗粒轮廓辨识度不高的缺点，在可见光下图像找到玉米颗粒位置和轮廓等信息；然后对紫外光下图像进行图像增强处理，将增强处理后的紫外光下图像与预处理后的可见光下图像进行掩膜操作，以此将黄曲霉毒素的荧光信息与玉米颗粒位置及轮廓信息进行结合。最后，在掩膜后的图像中，利用RGB颜色模型的阈值分割算法［24］找到能发出黄绿色荧光的含黄曲霉毒素的颗粒。

2 玉米图像预处理

2.1 目标提取

在紫外光源下采集的图像中，玉米颗粒与背景板均呈现蓝色，不容易标记出单粒玉米颗粒的位置和轮廓，因此首先对可见光下的图像进行处理，用于准确辨识玉米各颗粒轮廓及其在背景板中的位置。

在可见光源下获得的图像中不仅包含玉米颗粒信息，还包括背景板、试验台、标签等信息，若对全部图像进行处理，会有数据量大、处理时间长等问题，另外试验台、标签纸等也会对单粒玉米颗粒的位置提取造成干扰，因此在处理之前提取玉米颗粒排列的区域作为感兴趣区域，如图2所示。

图2 从原图中提取感兴趣区域

为进一步减轻运算量将彩色图像转化为灰度图像，根据人眼对3种颜色的敏感度不同，通过加权平均法实现图像灰度化［25］。转换结果如图3所示。

图3 灰度图像

为了将目标图像与背景分隔开［26］，在灰度图像中，根据玉米颗粒与背景之间在灰度值上存在的差异，使用阈值分割方法进行背景分割［27］。在阈值分割法中，认为图像中处于同一灰度范围内的像素点来自同一个物体［28］。从图4a所示的直方图中可看出背景和玉米颗粒各自形成1个波峰，因此选择处于两峰中间位置的波谷所对应的灰度值作为分离2个区域的阈值。进一步的，利用这个阈值将图像分成2部分G1和G2，并计算这2个区域的平均灰度值g1、g2，以此得到新阈值T＝（g1＋g2）／2，循环计算直到g1、g2的值不在发生变化［29］。结合直方图和计算结果，选取195为分割阈值，像素值小于195时认为是玉米颗粒，否则认为是背景。处理后结果如图4b。

图4 直方图和二值化图像

2.2 膨胀腐蚀去噪声

二值化后的图像存在一些椒盐噪声，试验中选择膨胀与腐蚀的方法予以消除。膨胀的作用是将与物体接触的所有背景点合并到物体中，使目标增大［27］，腐蚀是相对于膨胀的操作。在2次膨胀腐蚀处理后，二值图像中存在的椒盐噪声大部分已被去除了，但在玉米颗粒表面因反光而形成的孔洞也被放大了，因此需对这些空缺的区域进行填充。由于图像中在多个玉米颗粒上存在不同的孔洞，选择遍历查找玉米最外层轮廓并填充其内部的方法进行处理。填充后如图5所示，初步确定了每个玉米颗粒的位置。

图5 去噪声与填充后图像

3 图像处理

3.1 掩膜

为了在紫外光下获取的图像中找到玉米颗粒的位置，将其与预处理后的可见光图像进行掩膜计算［30］。遍历查找二值图像中每个像素点的灰度值，若此值为0，则将紫外光下图像对应的像素点信息复制到二值图像中，如图6显示，在掩膜后的图像中只在玉米颗粒区域处显示紫外光图像信息。

图6 掩膜后图像

3.2 黄曲霉菌毒素感染区域提取

本试验在RGB模型下，通过阈值分割法对玉米颗粒上感染黄曲霉毒素的部分进行提取［31］。从采集到的图片中看出黄曲霉毒素在365 nm紫外光下发出明显的黄绿色荧光，建立R［256］、G［256］、B［256］3个数组存储各个通道下的图像信息，在紫外光下黄绿色荧光区域的像素值范围分别为R：150～210，G：200～238，B：185～235。3个通道下直方图分别如图7所示。

图7 在3个通道下的直方图

从彩色直方图可以看出在G通道下有2个相对明显的波峰，且其荧光部分与背景的区分优于R和B通道，而且只采用G通道下阈值进行检测，不仅能够达到检测的目的，也能简化运算。但从这种方法只检测到了黄绿荧光信息相对明显的感染部分，检测准确率不高，如图8所示。因此为提高检测准确率，需要进一步对紫外光下图像进行优化或增强。

图8 检测结果

3.3 优化荧光图片

在荧光图像中进行图像增强操作可以扩大图像中不同物体特征之间的差别。参考MATLAB中的函数imadjust.m中式（2）进行图像增强。

式中：I为输入图像，J为输出图像，gamma为描述值I和J关系的曲线形状，将在low和high之间的值映射到bottom和top之间。在紫外图像中，对3个通道分别按照式（3）［32］进行调整

式中：B为一个通道中原像素值；B′为增强后像素值。可以看出图像增强后荧光部分更加明显（图9）。运行后检测的准确性显著提高，另外，为便于统计带荧光的玉米颗粒数。将含毒素的荧光区域的检测结果图像与玉米轮廓图像合并，从而显示出含有黄曲霉毒素的玉米颗粒，图像增强后检测结果如图10所示。

图9 彩色增强图像

图10 彩色增强后检测结果

4 结果与讨论

在图像检测结果中，将在玉米颗粒轮廓内含有黑像素的颗粒判定为含毒素颗粒，在HPLC检测结果中，将毒素含量超过20 mg／kg标准的颗粒判定为含毒素颗粒，将紫外光下荧光显示情况与HPLC的检测结果通过混淆矩阵表示。如表1所示，含有毒素的颗粒基本都发出荧光，其相关性达到0.82，基本可以将是否有荧光显示作为判定是否含有毒素的标准。另外为验证方法的准确性，将图像处理结果、紫外光下荧光显示结果、HPLC检测结果通过混淆矩阵表示，如表2所示。

表1 荧光显示与HPLC检测结果

表2 图像检测结果

从表2中可以看出，利用本试验提出的图像处理方法基本可以有效地识别出含有荧光反应的颗粒，其准确率为96.3%；但由于存在含有毒素却不显示荧光的假阴性现象，与不含毒素却显示荧光的假阳性现象，所以利用HPLC与图像检测结果进行对照，所提图像检测方法对含毒素颗粒的识别正确率为77.8%。

为进一步验证本试验方法的适用性，按照1.1方法提取出25粒玉米种子组成验证组，如图11a所示，与训练组相同方法进行图像获取及处理，其检测结果如图11b所示。验证组的检测结果分别在表1、表2中列出。

从表2结果可以看出，在验证组中利用本试验提出的图像处理方法对于含荧光颗粒的识别准确率能够达到84%，对含毒素颗粒的检测准确率为84%。

在图像中，部分玉米颗粒感染黄曲霉菌已经存在发黄发黑的现象，在紫外光下其色彩与发荧光部分的颜色非常接近，因此会出现将此类玉米粒判断为发荧光颗粒的现象，但总体来说这种方法对发荧光颗粒的识别准确率较高。

另外，由于有一部分颗粒呈现假阴性，这导致了这种图像检测方法对含毒素颗粒的漏检；同时也存在一些呈现假阳颗粒性，其仅含有黄曲霉菌的BYGF代谢产物，在紫外光下也会激发出荧光，这导致了图像检测的误判，但假阳性颗粒已含有黄曲霉菌，这类颗粒的误判在实际检测中是允许的。

图11 玉米颗粒荧光图像及其检测结果

这种方法作为含有黄曲霉颗粒的检测方法已有较好的检出效果，并且，本研究提出的通过机器视觉检测的方法与传统化学检测方法相比，减少了试样准备时间，不仅节省了费用，而且能够达到快速准确的要求，能够作为含毒素粮食在线检测的储备技术，在工业应用中具有广泛的前景，但是距离直接用作在线、快速动态分选检测设备的实用检测技术还有一些差距，因此进一步的工作重点主要包括：1）研究黄曲霉毒素荧光特征，分析其与BYGF代谢产物所发出荧光的区别减少假阳性颗粒的干扰；同时寻找未发出荧光的含毒素颗粒特征，寻找假阴性颗粒的检测方法；2）在确保检测准确度的同时进一步精简图像处理算法，研究相应的动态检测算法，为研制实用的霉变或毒素颗粒检出装备奠定基础。

5 结论

本研究主要对玉米颗粒静态高分辨图像进行分析处理，验证了机器视觉技术检测感染黄曲霉毒素的玉米的可行性。

基于采集的玉米颗粒在紫外光与可见光下的图像，在2种光源下2幅图像配合处理后，通过RGB模型下的阈值分割法，能够实现感染黄曲霉毒素玉米颗粒的检出。不仅可以清楚找到玉米颗粒位置，也可以找到单粒玉米颗粒上能够发出荧光的区域，优于单一光源下的图像的检测效果。

对紫外光下图像进行图像增强后，能够提高发荧光颗粒检出的准确率，在训练集和验证集中荧光颗粒的识别准确率分别为96.3%、84%；由于图像处理假阴性颗粒检测的不足，这种方法对训练集和验证集中含黄曲霉毒素颗粒的检测准确率分别为77.8%、84%。

试验结果表明本研究所提出的检出方法作为含黄曲霉毒素颗粒的假设检验方法是可行的，同时也可以作为霉变粮食在线分选检测和装备研制的储备技术。

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Detection Method of Corn Kernels Infected Aflatoxin Based on Color Features

Chu Xuan1Wang Wei1Lawrence Kurt C2Ni Xinzhi3Heitschmidt Gerald W2Zhang Nannan4PengYankun1

（College of Engineering，China Agriculture University1，Beijing 100083）（Quality＆Safety Assessment Research Unit2，USDA－ARS，Athens 30605，USA）（Crop Genetics and Breeding Research Unit3，USDA－ARS，Tifton 31793，USA）（College of Electrical and Electronic Engineering，Shandong University of Technology4，Zibo 255049）

Based on the special feature that corn kernels infected aflatoxin will emit visible fluorescence（bright greenish－yellow fluorescence，BGYF）when irradiated by 365 nm UVL，the new method for quickly and accuratelyscreening corn kernels infected with aflatoxin has been proposed in the paper.First，two images of the identical set of corn kernels were taken under the UVL and the LED light respectively.On the image acquired under LED light，image binaryzation and particle domain filling were used to determine the contour and positional information of each corn kernel.Second，the image obtained under UVL was enhanced and combined with the binary image under LED light by the mask method.Finally，the threshold value ofGchannel was used to screen the area of single kernel infected aflatoxin.The results showed that the accuracy of BYGF kernels and the kernels contained aflatoxin identification could be over 95%and 77.8%respectively，which indicated the usefulness of the proposed method.

corn kernel，aflatoxin，color fluorescence images，bright greenish－yellow fluorescence，non－destructive detection

S513 TP391.4

A

1003－0174（2015）04－0112－07

国家科技支撑计划（2012BAK08B04）

2013－12－31

褚璇，女，1990年出生，硕士，农产品品质安全检测技术及装置研究

王伟，男，1975年出生，副教授，农产品品质安全检测技术及装置研究