构树皮总黄酮提取及抗菌活性研究

开伟华，寇婉青，程 正，钱世兵，陈叶平

（1．铜陵职业技术学院医学系，安徽 铜陵 244000；安徽中医药大学药学院 安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥 230012；3．铜陵市食品药品检验所，安徽 铜陵 244000）

构树（Broussonetiapapyrifera（L．）Vent．）为桑科构属乔木，雌雄异株，又名谷浆树、楮桃树、沙纸树。构树的药用价值很高，其根、皮、叶、浆、果实和种子均可入药，具有抗氧化、抗血小板凝聚、降压、抗肿瘤、增强免疫和抑菌等作用［1］。其中，构树的抑菌作用一直受到人们的关注，如《本草纲目》云：“去风湿肿胀，癣疮。”《圣惠方》记载：“治癣湿痒不可忍，构树叶半斤，细切，捣令极烂，敷于癣上。”

构树皮又名楮树皮，性味甘平，能祛风、活血、利尿，可用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、虚肿、皮炎等。构树皮的化学成分主要为黄酮类、二苯丙烷类化合物以及香豆素、萜类、生物碱、脂肪油等［2－4］，黄酮类成分是构树皮多类化学成分中的主要成分，可作为特征性成分对其提取物进行表征。本研究采用正交设计法优化构树皮黄酮最佳提取工艺，并采用大孔吸附树脂富集构树皮总黄酮，比较不同洗脱部位抑菌效果，寻找构树皮有效的抑菌活性部位。

1 材料

1．1 药品与试剂 构树皮：安徽亳州中药材市场；98%槲皮素对照品：Sigma Aldrich；AB－8大孔树脂：国药集团化学试剂有限公司；三氯化铝（分析纯）：Sigma Aldrich；其他试剂均为分析纯。红色毛癣菌、白色念珠菌：安徽铜陵市食品药品检验所微生物室提供。

1．2 主要仪器 T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；电子分析天平：Shimadzu；鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

2 方法

2．1 测定波长的选择［5－7］取构树皮粗提物适量，精密称定，加甲醇使溶解，摇匀，制成含10mg／mL构树皮提取物溶液，作为供试品溶液。另取105℃干燥至恒质量的槲皮素对照品适量，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成0．1mg／mL槲皮素溶液，作为对照品储备液。精密量取槲皮素对照品储备液和供试品溶液各1．0mL，分别加入1%三氯化铝甲醇溶液各1 mL，摇匀，放置15min后，在200～600nm波长范围内进行扫描，以不加槲皮素标准液为空白，记录扫描图（见图1）。样品在270nm处的最大吸收峰和槲皮素吸收峰的重合度好，因此选择270nm为测定波长。

2．2 标准曲线绘制 精密量取槲皮素对照品储备液0、0．5、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0mL，分别置10mL具塞试管中，各加入1%三氯化铝－甲醇溶液1mL，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15min，以不加槲皮素标准液为空白，于270nm波长下测定吸光度，得出标准曲线A＝0．027C＋0．004 9，r＝0．999 8，说明槲皮素含量在0～50μg／mL浓度范围内具有良好的线性关系。

2．3 构树皮总黄酮提取 称取构树皮干燥粉末10．0g，加入不同体积倍数的乙醇，采用超声处理，滤过，合并滤液，减压回收溶剂浓缩至干，得到构树皮粗提物。分别称取构树皮粗提物，配置成10mg／mL供试品溶液，精密量取供试品液各1．0mL，分别加入1%三氯化铝甲醇溶液各1mL，摇匀，放置显色15 min后，由回归方程求出稀释液中总黄酮类化合物浓度，计算出构树皮总黄酮提取率。总黄酮提取率按下式计算：总黄酮含量＝（总黄酮量／浸膏量）×100%。

采用L9（34）正交试验设计，选用不同的乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声时间（C）、超声功率（D）为试验因素，优化超声法提取构树皮总黄酮最佳工艺参数，具体因素水平安排见表1。

表1 正交试验因素水平表

2．4 构树皮总黄酮富集 称取构树皮干燥粉末100．0g，按最佳提取工艺，超声提取，滤过，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味，浓缩液过滤后加水稀释为0．5g／mL生药溶液，按照药液－树脂比约1∶5上AB－8大孔吸附树脂，依次以蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇梯度洗脱，分别收集各流分，回收溶剂至干，分别得到30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位，按照“2．3”项下方法操作，自“加1%三氯化铝甲醇溶液”起，依法测定吸收度，计算出不同洗脱部位中总黄酮含量。

2．5 构树皮不同活性部位体外抑菌作用试验［8－9］选用红色毛癣菌和白色念珠菌，用平皿药基法［10－11］，以沙堡琼脂为基础培养基，分别取30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位浓缩提取物0．1g溶于适量水中，置100mL量瓶中，用灭菌双蒸馏水稀释至刻度。精密量取药液0．1mL加入8mL琼脂培养基中混匀，用灭菌双蒸馏水稀释成不同浓度，以溶剂及其基础为对照，用菌悬液法配成相当于0．5麦氏浊度的菌悬液备用，接种，培养，培养温度（26±1）℃，时间为7d，观测抑菌效果。

3 结果

3．1 构树皮总黄酮提取试验 正交试验结果见表2。方差分析结果见表3。由方差分析结果可知，总黄酮提取优选工艺条件为A2B1C2D3，而从极差看出影响总黄酮含量的主要影响因素为乙醇浓度和超声时间，从节约能源角度确定总黄酮提取最佳工艺为A2B1C1D1，即以10倍体积70%乙醇冷浸，超声20min，功率300W，总黄酮提取率最高。由表3可知，因素A对提取工艺有显著性影响，因素B、C、D对提取工艺的影响无统计学意义。

3．2 构树皮总黄酮验证试验 称取构树皮干燥粉末10．0g，按最佳工艺重复做3次，测得总黄酮含量平均值为2．18%。

表2 构树皮总黄酮的L9（34）正交试验结果

3．3 验证试验 称取构树皮干燥粉末10．0g，按最佳工艺重复做3次，测得总黄酮含量平均值为2．18%。

3．4 构树皮总黄酮富集分离 对得到的各乙醇洗脱部位测定总黄酮含量，结果见表4。总黄酮含量：70%乙醇洗脱部位＞50%乙醇洗脱部位＞30%乙醇洗脱部位＞90%乙醇洗脱部位。

表3 正交试验结果方差分析

表4 构树皮各部位总黄酮含量

3．5 构树皮各部位体外抑菌试验 构树皮提取物30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位提取物对红色毛癣菌和白色念珠菌均有一定的抑制作用，70%乙醇洗脱部位抑菌作用最强，50%乙醇洗脱部位次之，30%乙醇洗脱部位和90%乙醇洗脱部位抑菌作用最差，这与各部位总黄酮含量呈对应关系。见表5。

表5 不同浓度乙醇洗脱部位双蒸馏水液的抑菌作用

4 讨论

浅部真菌病是皮肤科临床最常见的皮肤病，是由寄生于角蛋白组织的致病真菌所引起的皮肤病。致病菌主要为皮肤癣菌，其次为浅部念珠菌，感染人体后可引起组织反应而发生红斑丘疹、水疱、鳞屑、断发、脱发和甲板改变等。目前，针对浅部真菌病的治疗，己开发了多种口服和外用抗真菌药物。化学药物具有一定的抗真菌作用，但由于真菌感染率的不断增加，真菌耐药菌株日益增多，加之化学药物的毒性和不良反应以及耐药性的产生，使得化学药物治疗难度不断增大，这种现状迫切要求人们不断寻找高效低毒的抗真菌药物。因此，从中草药中有效地提取、筛选抗真菌活性成分，寻找安全性好、抗菌谱广、疗效高的抗真菌药物已成为一个重要的研究方向［12］。

构树因其耐旱、耐湿、耐冷、萌芽力强，在自然界中有很强的适应性，在我国黄河两岸、大江南北、平原山区随处可见，资源非常丰富。本研究通过对构树皮总黄酮的提取、纯化以及不同洗脱部位的体外抑菌试验，确定构树皮最佳提取工艺为：取构树皮粉末，以10倍体积的70%乙醇为溶剂，超声提取20 min，功率300W，过滤，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味，再经AB－8大孔吸附树脂富集，依次以蒸馏水、30%、50%、70%和90%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱部位，浓缩至干，即得。该工艺操作简单、耗能低、总黄酮提取率高，对浅部真菌红色毛癣菌和白色念珠菌均有良好的抑制作用，为进一步开发抑菌活性强、质量可控、性质稳定且毒性和不良反应小的抑制浅部真菌制剂奠定了基础。

（铜陵市食品药品检验所管大平对构树原料进行了鉴定，铜陵市食品药品检验所微生物室提供了菌种，谨致谢意！）

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