高效液相色谱法－蒸发光散射检测器同时测定肝乐颗粒中黄芪甲苷和芍药苷的含量

姜 辉，王 斌，高家荣

（1．安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2．安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038）

肝乐颗粒（又名疏肝健脾方）为安徽中医药大学第一附属医院特色院内制剂，主治急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化活动期，疗效确切［1－2］。方中黄芪味甘微温，入脾、肺经，健脾益气；柴胡味苦辛微寒，入肝胆二经，疏肝解郁，两药合用则疏肝健脾并举，共为君药；白芍养血柔肝，茵陈、白术、茯苓、薏苡仁、猪苓健脾和胃渗湿为臣药；佐以泽兰活血化瘀，板蓝根清热解毒，以使毒消而正气自复。本实验在前期研究［3－5］基础上，采用高效液相色谱－蒸发光散射检 测 器 （high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detector，HPLCELSD）同时测定肝乐颗粒中君药黄芪活性成分黄芪甲苷和臣药白芍活性成分芍药苷的含量，以期建立该制剂的质量控制方法。

1 仪器与试药

1．1 仪器 Agilent1260型高效液相色谱仪（包括在线脱气机、二元泵、柱温箱、380－LC型ELSD）：美国安捷伦公司；HS10260D型超声清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；BP211D型十万分之一电子天平：德国赛多利斯公司。

1．2 材料 黄芪甲苷（批号110781－200512）和芍药苷（批号110736－200934）对照品由中国药品生物制品检定所提供。肝乐颗粒（批号分别为20121204、20131020、20130622）由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供；药材黄芪、柴胡、白芍、茵陈、板蓝根、薏苡仁、枳壳、白术、猪苓、茯苓和泽兰均购于合肥乐家老铺中药饮片有限公司，并经安徽中医药大学第一附属医院孟楣主任中药师鉴定；水为双蒸馏水，甲醇为色谱纯，石油醚和正丁醇等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 样品溶液的制备

2．1．1 对照品溶液的制备 精密称定黄芪甲苷对照品7．80mg，芍药苷对照品9．07mg，加甲醇各自定容至10mL容量瓶中。分别取黄芪甲苷对照品溶液0．5mL和芍药苷对照品溶液1．0mL，配制成混合对照品贮备液（黄芪甲苷和芍药苷的质量浓度分别为39．0、90．7μg／mL），置4℃冰箱中冷藏备用。

2．1．2 供试品溶液的制备 参照文献［6］方法，精密称取肝乐颗粒2．0g，置于具塞锥形瓶中，并加甲醇50mL，超声处理30min后滤过、蒸干，用水转移残渣至分液漏斗中，石油醚萃取脱脂后，再用水饱和的正丁醇萃取3次（依次为50、40、40mL），合并正丁醇液，80℃下减压浓缩后，加等体积氨试液洗涤3次，弃去氨洗液，取正丁醇液蒸干，甲醇溶解所得物，转移至10mL容量瓶中，定容，过0．45μL针式过滤器后待用。

2．1．3 阴性样品溶液的制备 按处方量分别制备缺黄芪和缺白芍阴性样品，按“2．1．2”项下方法制备阴性样品溶液，过0．45μL针式过滤器后冷藏待用。

2．2 色谱条件及系统适用性试验 以水和甲醇分别为流动相A 和流动相B，在 Hypersil ODS XB－C18柱（4．6mm×250mm，5μm）上进行梯度洗脱。洗脱程序：0～5min，A 60%；6～10min，A 25%；11～18min，A 10%；柱温：30 ℃；流速：1．2mL／min。ELSD参数设置：雾化器温度70℃，漂移管温度90℃，增益2．0，载气流量2．0L／min，进样量20μL。在上述条件下，肝乐颗粒中芍药苷和黄芪甲苷与其他组分色谱峰可实现基线分离，与阴性样品对比可知，在芍药苷和黄芪甲苷出峰处无干扰，理论塔板数以芍药苷和黄芪甲苷计均大于4 000，结果见图1。

2．3 线性关系考察 分别取混合对照品溶液2．0、5．0、10．0、15．0、20．0、25．0μL注入液相色谱仪，分别以2个对照品的6个进样量的峰面积积分值（y）为纵坐标，样品浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，芍药苷和黄芪甲苷的线性回归方程分别为：y1＝600．34x1－89．604，r1＝0．999 3；y2＝105．52x2－25．131，r2＝0．999 5。结果表明，芍药苷和黄芪甲苷进样量分别在0．078～0．975μg和0．181 4～2．267 5μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2．4 精密度试验 参照“2．2”项下的色谱条件，分别取芍药苷和黄芪甲苷混合对照品溶液20μL，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD。所得结果显示，芍药苷和黄芪甲苷峰面积的RSD（n＝6）分别为0．98%和0．47%，表明精密度良好。

2．5 稳定性试验 取“2．1．2”项下制得的样品溶液（批号20130622），从0h开始间隔4h分别进样20 μL，24h内共进样7次，记录各自峰面积。结果显示，芍药苷和黄芪甲苷峰面积的RSD分别为1．27%、1．94%。表明样品溶液在24h内基本稳定。

2．6 重复性试验 按“2．1．2”项下方法，取同一批号的样品（批号20130622），平行制备6份样品溶液，测得各自峰面积并计算含量。结果显示，芍药苷和黄芪甲苷含量的RSD分别为1．87%、1．04%。表明该方法重复性较好。

2．7 加样回收率试验 称取肝乐颗粒粉末6份，每份2．0g，精密称定，加入2mL混合标准品储备溶液（混合标准品储备溶液的制备：分别精密称取芍药苷和黄芪甲苷对照品3．32、34．98mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，摇匀，按供试品溶液制备方法制备后按上述色谱条件测定含量。计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2．8 样品含量测定 取批号分别为20121204、20131020、20130622的3批肝乐颗粒内容物，每批3份，按“2．1．2”项下方法制备样品溶液，共9份。样品经HPLC进样分析，并记录芍药苷和黄芪甲苷的峰面积，依照芍药苷和黄芪甲苷标准品线性方程，计算样品中芍药苷和黄芪甲苷的含量。结果见表2。

表2 3批肝乐颗粒中芍药苷和黄芪甲苷含量测定结果

3 讨论

3．1 检测器的选择 肝乐颗粒为中药复方，所含成分较为复杂，原先使用高效液相色谱－二极管阵列检测器测定芍药苷和黄芪甲苷的含量，由于芍药苷和黄芪甲苷的最大吸收波长分别在231nm［7］和200．8 nm［8］，200．8nm 属于末端吸收，杂质和噪音对该色谱峰的干扰也较大。此外，芍药苷和黄芪甲苷极性相差较大，需梯度洗脱才能同时测定，而梯度洗脱容易造成基线漂移，会给样品分析的准确度带来误差。2010年版《中华人民共和国药典》［9］规定药材黄芪的质量控制选用HPLC－ELSD测定黄芪中有效成分黄芪甲苷的含量，理论塔板数不低于4 000。ELSD作为一种通用质量型检测器，其响应不依赖样品的光学性质，只要样品的挥发性低于流动相即可被检测，不存在紫外末端吸收的问题［10］。所以，本实验采用HPLC－ELSD技术建立同时测定肝乐颗粒中黄芪甲苷和芍药苷含量的方法。

3．2 样品处理的优化 起初，样品用甲醇超声萃取后直接进样分析，但黄芪甲苷和芍药苷与其他杂质组分不能很好分离。后来参照2010年版《中华人民共和国药典》一部［9］中药材黄芪的处理方法，将样品用甲醇超声萃取后蒸干萃取液，用水转移残渣至分液漏斗中，石油醚脱脂，再用水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，减压浓缩，加等体积氨试液洗涤3次后弃去氨洗液，正丁醇液蒸干，最后用甲醇溶解后进样分析，样品中所含杂质明显减少且与黄芪甲苷和芍药苷都能实现很好分离。

3．3 ELSD条件的优化 使用ELSD时，蒸发温度、载气流速以及增益值对测定结果影响较大。为此，本研究选择蒸发温度（50、70、90、110 ℃）、载气流速（1．2、1．6、2．0、2．4L／min）和增益值（1、2、3）进行考察。结果显示，增益为1时黄芪甲苷和芍药苷的响应值最小，而增益为3时黄芪甲苷和芍药苷的峰面积分别比增益为1时提高了3．8倍和4．5倍，但此时信号／噪音比值却有所降低。相比较而言，增益为2时，可获得较好的信号／噪音比。因为安捷伦380－LC型ELSD的载气流速默认值为1．60L／min，故选择增益为2，载气流速为1．60L／min的参数下考察漂移管温度在50、70、90、110℃下黄芪甲苷和芍药苷的响应情况。结果显示，漂移管温度为90℃时无论是芍药苷还是黄芪甲苷，响应值均最大，因此，选择90℃作为样品分析的蒸发温度。最后，在优化了的参数（增益为2和蒸发温度为90℃）条件下继续考察载气流速（1．2、1．6、2．0、2．4L／min）对样品分析的影响。当载气的流速较低（1．2L／min）时，易形成大量的微粒，从而导致噪声信号或尖峰信号；相反，当载气流速较高（2．4L／min）时，微粒形成量降低，光的散射减弱，导致信号响应降低［6］。相比之下，载气流速为2．0 L／min时黄芪甲苷和芍药苷的基线噪音较小，但信号响应值却相对较高。故最终选定在增益为2，漂移管温度为90℃，载气流速为2．0L／min的参数下对肝乐颗粒进行质量控制研究。

［1］曹承楼，杨素霞，张国梁，等．肝乐冲剂治疗慢性病毒性肝炎肝郁脾虚证疗效观察［J］．河南中医，2007，27（10）：28－29．

［2］杨小军，张国梁，施卫兵，等．肝乐冲剂治疗乙型肝炎肝郁脾虚型60例临床观察［J］．浙江中医药大学学报，2010，34（3）：353－354．

［3］姜辉，吴芙蓉，薛雪，等．肝乐颗粒对肝纤维化大鼠纤维化指标的影响［J］．中国中医急症，2010，19（4）：636－637．

［4］姜辉，夏伦祝，汪永忠，等．肝乐颗粒对肝纤维化大鼠细胞因子的影响［J］．中国中医药科技，2011，18（1）：13－15．

［5］姜辉，尚莉丽，徐松龄，等．肝乐颗粒对肝纤维化大鼠的保护作用［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17（12）：167－170．

［6］王斌，孟楣，刘先华，等．高效液相色谱－蒸发光散射法检测芪白平肺胶囊中3种人参皂苷含量［J］．安徽中医药大学学报，2014，33（1）：78－81．

［7］王春艳，张丹参，张万明，等．HPLC／DAD测定柴胡疏肝散中4种活性成分的含量［J］．中成药，2010，32（3）：422－425．

［8］田南卉，杨国红，方颖，等．高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定黄芪和制剂中黄芪甲苷的含量［J］．药物分析杂志，2000，20（3）：199－200．

［9］国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部［M］．北京：中国医药科技出版社，2010：283－284．

［10］李迩娜，滕再进，刘世平，等．不同产地通关藤药材HPLC－ELSD指纹 图 谱 ［J］．中 国 中 药 杂 志，2012，37（11）：1610－1613．